奶牛結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

1、奶牛結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展牛結(jié)核?。˙ovine Tuberculosis）是由牛分枝桿菌引起的一種慢性傳染病。該病傳染性強(qiáng)，且能通過奶制品傳染給人和其他動物，危害嚴(yán)重，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為B 類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。牛結(jié)核病的診斷大體上可歸為兩類：一是臨床癥狀診斷；二是實(shí)驗(yàn)室診斷，包括細(xì)菌學(xué)檢測，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、動物實(shí)驗(yàn)等；免疫學(xué)檢測；分子生物學(xué)診斷技術(shù)等。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法由于繁瑣費(fèi)時、檢出率低、靈敏度差，已不能滿足當(dāng)前疫病診斷的需要。目前世界各國都在致力于研究開發(fā)牛結(jié)核病的快速診斷方法，并已經(jīng)建立了一些快速、準(zhǔn)確、可靠的新型檢測技術(shù)，有些技術(shù)已經(jīng)在生產(chǎn)

2、實(shí)踐中得到了廣泛的應(yīng)用。1 細(xì)菌學(xué)檢測細(xì)菌學(xué)檢查的方法有涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等。臨床上樣品中的牛分枝桿菌可通過涂片抗酸染色、鏡檢并通過細(xì)菌培養(yǎng)做出確認(rèn)。涂片抗酸染色法所需材料、設(shè)備簡單，操作方法簡便，是較為普遍應(yīng)用的方法。由于此法檢出的細(xì)菌只能說明有抗酸桿菌存在,而且也不能準(zhǔn)確地鑒定出結(jié)核分枝桿菌和非典型分枝桿菌，因此,其缺乏特異性。細(xì)菌培養(yǎng)需在37培養(yǎng)38 周才可生長。菌落形態(tài)粗糙，中心隆起，周圍大而邊緣不規(guī)則，菌落顏色微白。細(xì)菌培養(yǎng)法到目前為止仍被認(rèn)為是確診結(jié)核的黃金標(biāo)準(zhǔn)。但牛結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，有10%20%的病例結(jié)核菌培養(yǎng)失敗。同時由于各種條件的影響，陽性率較難提高。2 血清學(xué)檢測2.

3、1 傳統(tǒng)的結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（OT,PPD）OT 是老式皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，PPD 是目前公認(rèn)最有效的方法，也是被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）確定的法定檢疫方法，被世界各國接受和采用的方法。它主要是用提純的PPD 進(jìn)行牛皮內(nèi)接種，于72-96小時后觀察有無熱、痛、腫脹等反應(yīng)，對可疑的牛需60d 后再次復(fù)檢。該方法檢出率和準(zhǔn)確率都比較高。PPD 作為皮膚試驗(yàn)最大的缺點(diǎn)就是易呈現(xiàn)假陽性和假陰性反應(yīng)。當(dāng)感染副結(jié)核分枝桿菌等環(huán)境分枝桿菌時則可能呈現(xiàn)假陽性反應(yīng)，即PPD 中大多數(shù)蛋白質(zhì)與其他分枝桿菌和一些無關(guān)細(xì)菌的相同。對因感染其他分枝桿菌而致敏的動物沒有特異性，不能判斷病情，而且BCG 疫苗中含有與PPD

4、相同的抗原成分，因而PPD 皮內(nèi)試驗(yàn)不能鑒別是免疫動物還是感染動物。在一些國家，使用比較結(jié)核菌素試驗(yàn)（即比較皮內(nèi)試驗(yàn)，single intradermal comparativetuberculin test SICTT），在頸部一側(cè)的不同部位，同時注射牛型PPD 和禽型PPD 以判斷動物對兩種PPD 的不同反應(yīng)，能夠提示被檢動物是被牛分枝桿菌感染還是非特異的DTH 反應(yīng)。所以，以PPD 為診斷工具的TST反應(yīng)很難將結(jié)核菌顯性感染和隱性感染以及BCG 免疫的個體區(qū)分開來。2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）此類方法均是利用抗原抗體反應(yīng)檢測針對牛結(jié)核分枝桿菌抗原的循環(huán)抗體。目前用于檢測的抗原有

5、PPD、ESAT -6、CFP10、MPB59、MPB64 MPB70、MPB80、MPB83、Ag85、LAM（脂阿拉伯甘露聚糖）、LPS（脂多糖）等。ELISA 中也可以采用免疫過氧化物酶，這種方法與傳統(tǒng)ELISA 法相比，檢測速度更快、成本更低、操作更簡便。2.3 -干擾素試驗(yàn)將試驗(yàn)牛血樣的淋巴細(xì)胞加入特異性PPD 一起孵育1624h，由于致敏的淋巴細(xì)胞能夠釋放出-干擾素，因此可用INF-ELISA 進(jìn)行定量測定。通過對結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)的研究表明ESAT-6蛋白僅存在于結(jié)核桿菌復(fù)合體及少數(shù)致病性分枝桿菌中，90%以上的分枝桿菌不具有ESAT-6 蛋白，因而將ESAT-6

6、 蛋白作為刺激抗原來檢測釋放到血中的INF- 水平是診斷牛結(jié)核病的較好方法。免疫學(xué)試驗(yàn)證明在ESAT-6 蛋白上存在著T 細(xì)胞和B 細(xì)胞抗原表位，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，這極大地推動了以ESAT-6 作為診斷試劑的研究價值。 干擾素試驗(yàn)優(yōu)于結(jié)核菌素試驗(yàn)的一個特點(diǎn)就是，即使動物體內(nèi)抗原很少也能被檢出，且可重復(fù)檢查。由于接種了BCG 使PPD 試驗(yàn)很難對結(jié)核分枝桿菌的感染做出診斷，因此，迫切需要建立一個新的細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測方法，而全血IFN- 檢測方法很有可能成為替代傳統(tǒng)的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)的結(jié)核病臨床輔助診斷方法。1990 年，Wood 等建立了一種快速診斷牛分枝桿菌致病的細(xì)胞因子（

7、INF-）檢測方法，即在體外用結(jié)核菌素或牛型分枝桿菌來源的PPD 刺激全血，檢測釋放到血中的INF- 水平，因此顯著提高了檢測家畜牛分枝桿菌感染的敏感性。1991 年澳大利亞動物健康委員會將該法確定為檢測牛分枝桿菌的正式實(shí)驗(yàn)方法。1994 年該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)被進(jìn)一步修改，可用于診斷牛分枝桿菌和禽分枝桿菌感染，并且證明該法可用于區(qū)分這兩種感染。綜上所述，由于全血INF- 水平對結(jié)核分枝桿菌感染的檢測具有高度的敏感性和特異性，因此該技術(shù)為結(jié)核病的早期診斷并盡快實(shí)施化療提供了新的方法。10 倍稀釋的全血INF- 檢測實(shí)驗(yàn)，不但能夠用于不同人群對特異性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的監(jiān)測，或者用于檢測結(jié)核菌感染的病人在一

8、段時間內(nèi)免疫應(yīng)答水平的改變及評價化療效果，也可對由BCG 或其他更有效的抗結(jié)核疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)力進(jìn)行研究。2.4 淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)致敏的外周血淋巴細(xì)胞（PBL） 在特異性抗原（ 如PPD、MPB70、MPB64 和MPB59 等）刺激下，可使抗原特異性T 淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生增生反應(yīng)。通過測定外周血循環(huán)中的增生淋巴細(xì)胞的比例可了解淋巴細(xì)胞增生的程度，間接反映淋巴細(xì)胞被特異性抗原致敏的情況，從而分析動物機(jī)體對牛分枝桿菌的細(xì)胞免疫狀態(tài)。淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)主要是測定全血樣品對結(jié)核菌素PPD 抗原的細(xì)胞反應(yīng)，因其費(fèi)用較高，主要用于珍貴野生動物的檢查?？偟膩碇v，血清學(xué)試驗(yàn)的低敏感性歸因于分枝桿菌感染引

9、起的機(jī)體免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫占主導(dǎo)而非體液免疫。因此，血清學(xué)試驗(yàn)最好是作為細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)的補(bǔ)充而不是替代。3 分子生物學(xué)技術(shù)常用的結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 技術(shù)、以PCR 為基礎(chǔ)的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和間隔寡核苷酸分型技術(shù)（Spoligotyping）。3.1 PCR 技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對人結(jié)核和牛結(jié)核的診斷有很高的應(yīng)用價值。應(yīng)用PCR 可檢測出250fg 牛分枝桿菌純化DNA，菌細(xì)胞的敏感度為50 個菌，且整個檢測過程僅需2d。蔡宏等用基因探針原位雜交技術(shù)檢測福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的牛分枝桿菌，在幾天內(nèi)就可獲知分析結(jié)果。該法省去了為從組織

10、中提取結(jié)核菌而進(jìn)行的組織研磨處理及結(jié)核桿菌DNA 提取等繁瑣步驟，敏感性為104105 個細(xì)菌/mL。3.2 RFLP 技術(shù)和Spoligotyping 技術(shù)RFLP 和Spoligotyping 技術(shù)主要用于結(jié)核病流行病學(xué)，對結(jié)核菌型的鑒定有重要意義。該方法只需少量的DNA，直接利用細(xì)菌裂解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，不需要對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)來提取DNA。4 結(jié)語牛結(jié)核病的控制和永久根除需要政府部門和廣大獸醫(yī)工作者的共同努力才能實(shí)現(xiàn)。提高診斷技術(shù)和研究更有效的疫苗是實(shí)現(xiàn)結(jié)核病根除的有效方法。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有亞單位疫苗、活載體疫苗和新型DNA 疫苗的問世，為牛結(jié)核病的檢測和預(yù)防提供了一條嶄新的途徑。活體電穿孔法導(dǎo)入DNA 疫苗已經(jīng)在牛和羊個體上獲得成功。研究表明