流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟

1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，按1X106cells/mL以1mL接種于100mmg養(yǎng)皿內(nèi)24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加藥，照射）特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)收集原培養(yǎng)液，洗后的PBSffi消化后的細(xì)胞，將三者混勻放入15ml離心管中1000rpm離心5min（短時(shí)低速離心）棄上清，用1.5ml預(yù)冷PBS1000rpm離心5min后去除PBSffi細(xì)胞懸液內(nèi)的細(xì)胞碎片加入1.5ml預(yù)冷PBS,在渦旋狀態(tài)下加入3.5ml無水乙醇，混勻后，于4c固定30min,或-20C長期保存。1000r/min,離心5min將乙醇吸除，力口PBS青洗混勻1000r/min

2、,5min再離心一遍，將殘留在細(xì)胞上的乙醇除去吸除離心管內(nèi)PBS力口入200ulPBS和2ul的RNAB(0.25mg/ml)(37C下孵育30min)加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室溫下避光染色30min將離心管內(nèi)的細(xì)胞過濾（300um尼龍網(wǎng)膜）至含有PBS的EP管中（PI具有很強(qiáng)的粘附性，容易使細(xì)胞聚團(tuán)），標(biāo)記EP管提前一天網(wǎng)上預(yù)約開機(jī)（先開儀器后開軟件）流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)一般分為5部分：流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；激光光源及光束成形系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號(hào)檢測(cè)、存貯、顯示、分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)。檢測(cè)前先渦旋使細(xì)胞混勻懸浮呈單個(gè)細(xì)胞，然后插入流式細(xì)胞儀上流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，細(xì)胞排成單列由噴嘴

3、中心噴出，形成細(xì)胞液柱液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光（488nm激發(fā)光源）熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析（熒光染料和細(xì)胞DN粉子特異性結(jié)合，可以檢測(cè)出細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例）在用第三方軟件分析之前，將流式結(jié)果按如下所示導(dǎo)出rxportrri.o科”叱Sup/*hHPreviewMhILwClrl+Pds'lij$ooi*lQHGju精r&0結(jié)果分析Modfit軟件分析|MlfcfijrvaiirlIFlowjo軟件分析癡0中kIB,LIHLIW1圖片拷貝：直接Ctrl+CEiLvEAriInkKsOrn|HITIttH11Ili*t”；J201306

4、20a-tics丁丁2n20130620a-2.fcs1W»U2013062Da-3fCs43566I；2013062DM.tCST2441U2013062Ua-Efc&tM72U20130620a-6fcs34700II20i3062)a-7it531317U即1和惻a闋Its30454d2013Q6ZDa-9.Tcs31552；20130620a-w.res35351U2Q13062Da-11.ftS33093；2013062Da-12.fc&2769U2013062Da-I3.fc&34&BJU201306208-14ItsI1&31tE

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6、SC-HUn:ForwardScatter.w一HiO山里我需褐sonLZp加Ecn*口ID-即口2QD。恒I*OptionsRED-W:RdFfuorescence.RedHupreBcenct，iid±hiJtED-1)1,RedFLacr工：胤皿孫,即Coimt：J7»j56/39512StalL£tB<!S：43.17STrtiI匚&皿t3W12yM512hStbtEtiCK2":百11苫，1.川ItJ,:20Iki*'>陽1孝*_融1恒4劉怵二201刊*.必翔720130(.,M1kiEFCM-DN/fi分析1個(gè)細(xì)胞

7、增殖群時(shí)，可將DNA含量分布組方圖分為三部分，即G0/1、S、G2IMG0/1和G2M細(xì)胞峰的DNA分布均為正態(tài)分布，S期可以認(rèn)為是一個(gè)加寬的正態(tài)分布檢測(cè)結(jié)果刻錄光盤保存關(guān)機(jī)（先關(guān)軟件后關(guān)儀器，關(guān)機(jī)前需清洗）正常細(xì)胞DNA量：2n-4n凋亡細(xì)胞：核內(nèi)DN幽裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內(nèi)DN蛤量減少。PI染色后，熒光強(qiáng)度減小而形成一個(gè)DN蛤量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）。1、縱坐標(biāo)CellNumber：即計(jì)數(shù)的有效細(xì)胞數(shù)；2、橫坐標(biāo)DNAContent:即DN蛤量；3、G1、G2、S三期在圖中已經(jīng)標(biāo)示；4、右側(cè)數(shù)字含義：DipG1-53.84%at55.56，即G1期DN

8、A含量平均值為55.56;53.84%即G1期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的53.84%;DipG2-5.64%at107.72,即G2期DN蛤量平士勻值為107.72,5.64%PG2期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的5.64%;AnnexinV-EGFP/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡基本原理：磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素V（AnnexinV）發(fā)生特異結(jié)合；PI是核酸熒光染料，不能透過正常細(xì)胞膜，只能進(jìn)入已經(jīng)破損的細(xì)胞膜，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，熒光強(qiáng)度與PI結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系。正常細(xì)胞：膜完整，PS不外翻一一PI-/AnnexinV-凋亡早期：膜完整，PS翻轉(zhuǎn)PI-/AnnexinV+凋亡晚期：PS外翻，膜通透，性

9、增加一一PI+/AnnexinV+壞死細(xì)胞：膜嚴(yán)重破損，PS不外翻PI+/AnnexinV+幾乎不存在膜結(jié)構(gòu)PI+/AnnexinV-實(shí)驗(yàn)步驟：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按1X106cells/mL以1mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi)24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加入藥物）特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用0.25%夷酶37c消化5min（胰酶消化時(shí)間不易過長，以防引起假陽性）加入PBS制成細(xì)胞懸液（移液槍吹打6-8次）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)（單個(gè)分離懸?。⒓?xì)胞懸液移入15ml離心管中2000rpm離心5min,PBS吸除用PBS清洗細(xì)胞2次（2000rpm,離心5min收集細(xì)胞）用400ul1xBindingBuffer懸浮細(xì)胞（濃度大約為1x106cells/ml）在細(xì)胞懸液中加入5ulAnnexinV-EGFP,輕輕混勻后于2-8C避光條件下孵育15min加入10ulPI后輕輕混勻，于2-8C避光條件下孵育5min在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長采用Ex.=488nm雙波長激發(fā)，Em.=510nm檢測(cè)EGF限光(FL1channel)和575nm的發(fā)射波長檢測(cè)PI。細(xì)胞應(yīng)可分成三個(gè)亞群：活細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，凋亡細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，壞