第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

1、Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism微生物發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶王曉濤王曉濤酶的生產(chǎn)方法提取分離法提取分離法(Extraction)(Extraction)生物合成生物合成(Biosynthesis)(Biosynthesis)化學(xué)合成化學(xué)合成(chemicalsynthesis)(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease

2、 from BacillusPhosphatase from BacillusPlant cell cultureAnimal cell culturesynthetic insulin 酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)方法 生物合成法生物合成法 植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 提取分離法提取分離法化學(xué)合成法化學(xué)合成法微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶動物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶動物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶Contents of chapter 21、微生物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)2、產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)3、酶的發(fā)酵工藝條件及控制4、酶發(fā)酵動力學(xué)GoGoGoGo5、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶6、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶GoGo2

3、.1 微生物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)1、中心法則- Central Dogma 2、RNA的生物合成- Transcription3、蛋白質(zhì)的生物合成- Translation4、酶生物合成的調(diào)節(jié)- RegulationGoGoGoGo5、酶生物合成的模式- Pattern Go一、中心法則一、中心法則-Central Dogma 二、RNA的生物合成(轉(zhuǎn)錄)- Transcriptionn起始位點(diǎn)的識別起始位點(diǎn)的識別 recognitionrecognitionn轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始 initiationinitiationn鏈的延伸鏈的延伸 elongationelo

4、ngationn轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止 terminationterminationn轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工 modificationmodificationThe E. coli RNA polymerase holoenzyme consists ofsix subunits: catalytic subunitsPromoterspecificityRNARNA合成過程合成過程起始起始雙鏈雙鏈DNA局部解開局部解開磷酸二酯磷酸二酯鍵形成鍵形成終止階段終止階段解鏈區(qū)到達(dá)解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)基因終點(diǎn)延長階段延長階段5 3 RNA 啟動子（啟動子（promotor) 終止子終止子(terminator)

5、5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 離開離開RNA前體的加工前體的加工加工類型加工類型作作 用用剪切反應(yīng)將RNA前體剪切為相對分子質(zhì)量較小的成熟RNA分子剪接反應(yīng)將內(nèi)含子除去，使兩端外顯子連接在一起，成為成熟的RNA分子末端連接反應(yīng)在3-末端加上若干個(gè)核苷酸，在5-末端加上“帽子”結(jié)構(gòu)或加上一個(gè)核苷酸核苷修飾反應(yīng)進(jìn)行核苷酸修飾，如在核苷的堿基或核糖上進(jìn)行甲基化修飾等三、蛋白質(zhì)的合成三、蛋白質(zhì)的合成( (翻譯翻譯)-Translation)-Translation翻譯翻譯: : 以以RNARNA中中mRNAmRNA為模板為模板, ,按照其按照其 核苷酸順序所組成的密碼指核苷酸順序

6、所組成的密碼指 導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成的過程導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成的過程. .mRNAmRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯 各種信息各種信息 各種蛋白質(zhì)各種蛋白質(zhì)（核苷酸排列順序）（核苷酸排列順序） （氨基酸排列順序）（氨基酸排列順序）蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-mRNA(模板，模板，template)nmRNAmRNA是帶有是帶有DNADNA遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接模板。模板。n以以mRNAmRNA為模板為模板, ,合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過程合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過程( (翻翻譯譯) )，就是將，就是將mRNAmRNA分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變

7、成蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。成蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-遺傳密碼，nucleotide triplet codonnmRNAmRNA分子中分子中, ,每三個(gè)相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種每三個(gè)相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息，稱為氨基酸或其它信息，稱為密碼子密碼子或或三聯(lián)密碼三聯(lián)密碼。n四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成4 43 3個(gè)即個(gè)即6464個(gè)密碼子。其中：個(gè)密碼子。其中：n一個(gè)起始密碼一個(gè)起始密碼: : AUGAUGn三個(gè)終止密碼三個(gè)終止密碼: : UAA UGA UAGUAA UGA UAGn多數(shù)氨基酸擁有多數(shù)氨基酸擁

8、有 2-42-4個(gè)密碼個(gè)密碼蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素- 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (transporter)酪酪555533AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰- tRNA反密碼反密碼mRNA密碼密碼(codon)(codon)與反密碼與反密碼(anticodon)(anticodon)的堿基配對的堿基配對蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-核糖體，ribosomen核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質(zhì)和rRNA組成。是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微小顆粒。蛋白質(zhì)的合成過程n肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始 initiationn肽鏈合成的延伸肽鏈合成的延伸 elongationn肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放 terminat

9、ion and releasen合成多肽的輸送和加工合成多肽的輸送和加工 transport and modificationn蛋白質(zhì)分子的折疊蛋白質(zhì)分子的折疊 folding原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子（Initiation Factor）的參與下，核糖體30 S亞基，fMet- tRNAF ，mRNA和50 S 亞基結(jié)合，組成起始復(fù)合物的過程。主要包括5個(gè)步驟：（1）30 S亞基與起始因子IF3 結(jié)合；（2）30 S亞基與mRNA結(jié)合，形成30 S-IF3-mRNA復(fù)合物；（3）fMet- tRNAF 與起始因子IF2以及GTP結(jié)合，生成fMet- tRNAF -IF2-

10、GTP；（4）在起始因子IF1的參與下，fMet- tRNAF-IF2-GTP與30 S-IF3-mRNA結(jié)合生成30 S起始復(fù)合物。在此30 S起始復(fù)合物中，fMet- tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結(jié)合；（5）50 S亞基與上述30 S起始復(fù)合物結(jié)合，形成完整的70 S核糖體。同時(shí)放出IF1，IF2，IF3 ，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70 S核糖體形成時(shí)，fMet- tRNAF 位于70 S核糖體的“P”位（肽?；唬?，而它的“A”位（氨?；唬┦强瘴?。 蛋白質(zhì)合成起始進(jìn)進(jìn)位位轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)位位成肽成肽合成終止四、酶生物合成的調(diào)節(jié)四、酶生物合成的調(diào)節(jié) (regu

11、lation)定義：定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。進(jìn)行的。意義：意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。 操縱子操縱子基因表達(dá)的協(xié)同單位基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子操縱子結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì)（編碼蛋白質(zhì), structural gene, S）控制部位控制部位操縱基因（操縱基因（operator gene, O）啟動子（啟動子（promotor gene, P）Jacob and Monod的的基因操縱子調(diào)節(jié)系

12、統(tǒng)示意圖基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 啟動基因啟動基因 操縱基因操縱基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 DNA 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 mRNA 翻譯翻譯 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物 控制區(qū)控制區(qū) 信息區(qū)信息區(qū)操縱子操縱子 cAMP-CAP復(fù)合物的作用示意圖 啟動基因（啟動基因（promotor genepromotor gene）（啟動子）：）（啟動子）： 有兩個(gè)位點(diǎn)：有兩個(gè)位點(diǎn)： （1 1）RNARNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。的結(jié)合位點(diǎn)。CAPCAP：環(huán)腺苷酸受體蛋白

13、：環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP receptor protein(cAMP receptor protein，CAPCAP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點(diǎn)上，復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點(diǎn)上，RNARNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點(diǎn)上，酶的合聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點(diǎn)上，酶的合成才能開始。成才能開始。 RPOSDNACAP-cAMP復(fù)合物CAP+cAMP( (二二) ) 酶合成調(diào)節(jié)的類型酶合成調(diào)節(jié)的類型 1.1.誘導(dǎo)誘導(dǎo) (induction)(induction) 組成酶：細(xì)胞固有的酶類。組成酶：細(xì)胞固有的酶類。 誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)

14、構(gòu)類誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似似 物而臨時(shí)合成的一類酶。物而臨時(shí)合成的一類酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression)(repression) 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression)(catabolite repression) 反饋?zhàn)瓒舴答佔(zhàn)瓒?feedback repression)(feedback repression) 酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；半乳糖苷透過酶； -半乳糖乙?；赴肴樘且阴；浮?shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長

15、在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；內(nèi)無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成需要時(shí)才合成。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 關(guān)關(guān) 閉閉啟啟動動子子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟啟動動子子ORmRNAZmRNAYmR

16、NAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（無活性）（無活性） 基基 因因 表表達(dá)達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)B、乳糖酶的誘導(dǎo)、乳糖酶的誘導(dǎo)乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）誘導(dǎo)誘導(dǎo) 2. 2.末端產(chǎn)物阻遏末端產(chǎn)物阻遏 由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現(xiàn)象：酶合成阻遏的現(xiàn)象： 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)： （1）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)， 檢測到檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合）在上述培養(yǎng)

17、基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟(jì)原則菌體生長的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成不需要就不合成。酶酶的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)和和阻阻遏遏操操縱縱子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因操縱基因啟動基因啟動基因調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因阻遏蛋

18、白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合, 結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白阻遏蛋白(無活性無活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物調(diào)控方式 阻遏蛋白 添加物與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘

19、導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性阻遏物不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比3.3.分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏n指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會阻遏利用存在時(shí)，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)

20、用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對數(shù)生長期中間隔開一個(gè)生長延滯期的對數(shù)生長期中間隔開一個(gè)生長延滯期的“二次生長現(xiàn)二次生長現(xiàn)象象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（受體蛋白（CAPCAP）。）。02468020406080 細(xì)胞濃度(OD)時(shí)間(h)分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏RLacZLac

21、YLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表達(dá)達(dá)CAP基因基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)結(jié)合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代謝產(chǎn)物謝產(chǎn)物腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系的關(guān)系cAMPCAP：環(huán)腺苷酸受體蛋白：環(huán)腺苷酸受體蛋白降低降低cAMP濃度濃度使使CAP呈失活狀態(tài)呈失活狀態(tài)五、酶生物合成的模式五、酶生物合成的模式根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)酶的關(guān)系, 把酶生物合成的模式分為：同步合成型同步合成型，延續(xù)合成型延續(xù)合成型，中期合成型中期合成型

22、和滯后合成型滯后合成型4種類型。 同步合成型同步合成型 酶的生物合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型生長偶聯(lián)型。 大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成。此種模式進(jìn)行生物合成。 例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶（EC3.1.1.20）。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度 活細(xì)胞濃度胞外酶濃度 胞內(nèi)酶濃度延續(xù)合成型延續(xù)合成型 酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長

23、進(jìn)入平衡期后，酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時(shí)間。酶還可以延續(xù)合成一段較長時(shí)間。 屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）的生物合成。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物 以含有葡萄糖的果膠為誘導(dǎo)物 中期合成型中期合成型 該類型的酶在細(xì)胞生長一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平該類型的酶在細(xì)胞生長一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止衡期以后，酶的生

24、物合成也隨著停止。 例如，枯草桿菌堿性磷酸酶（EC 3.1.3.1)的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應(yīng)產(chǎn)物無機(jī)磷酸的反饋?zhàn)瓒?，而磷又是?xì)胞生長所必不可缺的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷的存在。這樣，在細(xì)胞生長的開始階段, 培養(yǎng)基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當(dāng)細(xì)胞生長一段時(shí)間， 培養(yǎng)基中的磷幾乎被細(xì)胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30 min左右，所以當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后， 酶的生物合成隨著停止。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml滯后合成型滯后合成型 此類型酶是在細(xì)胞生長一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才

25、開始其生此類型酶是在細(xì)胞生長一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型非生長偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。屬于這一類型。 屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞生長一段時(shí)間甚至進(jìn)入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。后，酶才開始大量合成。該類型酶的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后的相當(dāng)長的一段時(shí)間

26、內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml理想的酶合成模式理想的酶合成模式n酶所對應(yīng)的酶所對應(yīng)的mRNAmRNA的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存在在是影響酶生物合成模式的主要因素。在酶的發(fā)酵是影響酶生物合成模式的主要因素。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，生產(chǎn)中， 為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式應(yīng)是的合成模式應(yīng)是延續(xù)合成型延續(xù)合成型。n對于其他合成模式的酶，可以通過基因工程其他合成模式的酶，可以通過基因工程 細(xì)胞工細(xì)胞工程技術(shù)程技術(shù), ,選育得到優(yōu)良的菌株選育得到優(yōu)良的菌株, , 并通過并

27、通過工藝條件的優(yōu)工藝條件的優(yōu)化控制化控制, , 使他們的生物合成模式更加接近于延續(xù)合使他們的生物合成模式更加接近于延續(xù)合成型成型。（1 1）選擇最理想的酶合成模式）選擇最理想的酶合成模式延續(xù)合成型；延續(xù)合成型；（2 2）改造非理想模式）改造非理想模式 A A、同步合成型：適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提、同步合成型：適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提 高相應(yīng)的高相應(yīng)的mRNAmRNA的穩(wěn)定性；的穩(wěn)定性； B B、滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝、滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝 物阻遏，使酶合成提早開始；物阻遏，使酶合成提早開始； C C、中期合成型：努力提高、中期合成型：努力提高mRNAmRNA穩(wěn)定性

28、，解穩(wěn)定性，解 除代謝物阻遏物。除代謝物阻遏物。選擇與改造選擇與改造總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素1 1）mRNAmRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性 高：可在細(xì)胞停止生長后繼續(xù)合成酶高：可在細(xì)胞停止生長后繼續(xù)合成酶 差：隨著細(xì)胞停止生長而終止酶的合成差：隨著細(xì)胞停止生長而終止酶的合成 2 2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在）培養(yǎng)基中阻遏物的存在 不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長而開始酶的合成。不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長而開始酶的合成。 受阻遏：細(xì)胞生長一段時(shí)間或平衡期后，酶才開受阻遏：細(xì)胞生長一段時(shí)間或平衡期后，酶才開始合成。始合成。六、提高酶產(chǎn)量的策略六、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選

29、育（一勞永逸）（一）菌種選育（一勞永逸） 1.1.誘變育種誘變育種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株選育組成型突變株(2)(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜褪棺瓒粜妥優(yōu)槿プ瓒粜?選育營養(yǎng)缺陷型突變株選育營養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋?zhàn)瓒艚獬答佔(zhàn)瓒?選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏解除分解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變選育抗分解代謝阻遏突變株株 2. 基因工程育種基因工程育種 （二）條件控制（二）條件控制1. 1. 添加誘導(dǎo)物添加誘導(dǎo)物 酶的底物類似物最有效。酶的底物類似物最有效。舉例舉例2. 2. 降低阻遏物濃度降低阻遏物濃度 舉例舉例 除去

30、終產(chǎn)物除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏產(chǎn)物阻遏 添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑 避免使用葡萄糖避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏 避免培養(yǎng)基過于豐富避免培養(yǎng)基過于豐富 添加一定量的添加一定量的cAMPcAMP3.3.添加表面活性劑添加表面活性劑 舉例舉例 離子型離子型 對細(xì)胞有毒害作用對細(xì)胞有毒害作用表面活性劑表面活性劑 TweenTween80 80 非離子型非離子型 TritonXTritonX1001004. 4. 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑 舉例舉例（1 1）例如：大腸桿菌生長在以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中，每個(gè)細(xì)胞）例如：大腸桿菌生長在以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中，每個(gè)

31、細(xì)胞平均只含有平均只含有1 1分子分子-半乳糖苷酶。若將該細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有乳糖而不含葡半乳糖苷酶。若將該細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有乳糖而不含葡萄糖的培養(yǎng)基中，萄糖的培養(yǎng)基中，2min2min后開始大量產(chǎn)生后開始大量產(chǎn)生-半乳糖酶，平均每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生半乳糖酶，平均每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生30003000分子分子-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 酶的作用底物誘導(dǎo)酶的作用底物誘導(dǎo) （2）例如：半乳糖醛酸是果膠酶催化果膠水解的產(chǎn)物，它卻）例如：半乳糖醛酸是果膠酶催化果膠水解的產(chǎn)物，它卻可以作為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)果膠酶的產(chǎn)生?？梢宰鳛檎T導(dǎo)物，誘導(dǎo)果膠酶的產(chǎn)生。酶的反應(yīng)產(chǎn)物誘導(dǎo)酶的反應(yīng)產(chǎn)物誘導(dǎo) （3 3）例如：異丙基）例如：異丙基-D-D-硫代

32、半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）對）對 - -半乳糖半乳糖苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍，蔗糖甘油單棕櫚酸酯對蔗糖酶苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍，蔗糖甘油單棕櫚酸酯對蔗糖酶的誘導(dǎo)效果比蔗糖高幾十倍等。的誘導(dǎo)效果比蔗糖高幾十倍等。酶作用底物的類似物誘導(dǎo)酶作用底物的類似物誘導(dǎo) Back例如：枯草桿菌堿性磷酸酶受其反應(yīng)產(chǎn)物無機(jī)磷酸的阻遏，例如：枯草桿菌堿性磷酸酶受其反應(yīng)產(chǎn)物無機(jī)磷酸的阻遏，當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)磷含量在當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)磷含量在1.0mol/mL1.0mol/mL以上時(shí)，該酶的合以上時(shí)，該酶的合成完全受阻。當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)磷含量在成完全受阻。當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)磷含量在0.01mol/mL0.0

33、1mol/mL以下以下時(shí)，該酶大量產(chǎn)生。所以，為了提高堿性磷酸酶的產(chǎn)量，時(shí)，該酶大量產(chǎn)生。所以，為了提高堿性磷酸酶的產(chǎn)量，必須限制培養(yǎng)基中無機(jī)磷的含量。必須限制培養(yǎng)基中無機(jī)磷的含量。 再如，再如， - -半乳糖苷酶受葡萄糖引起的分解代謝物半乳糖苷酶受葡萄糖引起的分解代謝物阻遏作用。在培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)，即使有誘阻遏作用。在培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)，即使有誘導(dǎo)物存在，導(dǎo)物存在， - -半乳糖苷酶也無法大量產(chǎn)生。只有半乳糖苷酶也無法大量產(chǎn)生。只有在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中，或在葡萄糖被細(xì)胞利用在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中，或在葡萄糖被細(xì)胞利用完后，誘導(dǎo)物的存在才能誘導(dǎo)該酶大量生成。完后，誘導(dǎo)物的存在才能誘

34、導(dǎo)該酶大量生成。Back如：吐溫（如：吐溫（TweenTween）、特里頓（）、特里頓（TritonTriton）等，）等，可積聚在細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞的通透性，有利可積聚在細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞的通透性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的產(chǎn)量。例如，在于酶的分泌，所以可增加酶的產(chǎn)量。例如，在木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基中，添加木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基中，添加1%1%的的吐溫，可使產(chǎn)酶量提高吐溫，可使產(chǎn)酶量提高1-201-20倍。倍。 Back產(chǎn)酶促進(jìn)劑指可促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理并未闡產(chǎn)酶促進(jìn)劑指可促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理并未闡明清楚的物質(zhì)。明清楚的物質(zhì)。 例如：添加植酸鈣鎂可使霉菌蛋白酶或者例如：添加植

35、酸鈣鎂可使霉菌蛋白酶或者橘青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高橘青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1-201-20倍。添加聚倍。添加聚乙烯醇（乙烯醇（Polyvinyl alcoholPolyvinyl alcohol）可提高糖化酶）可提高糖化酶的產(chǎn)量。聚乙烯醇、乙酸鈉等對提高纖維素酶的產(chǎn)量。聚乙烯醇、乙酸鈉等對提高纖維素酶的產(chǎn)量也有效果等。的產(chǎn)量也有效果等。Back2.2 2.2 產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)用于酶生產(chǎn)的微生物有以下特點(diǎn)：用于酶生產(chǎn)的微生物有以下特點(diǎn)：（1 1）酶的產(chǎn)量高；）酶的產(chǎn)量高；（2 2）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；（3 3）容易培養(yǎng)和管理；）容易培養(yǎng)和管理；（4 4）利于酶的分離純

36、化；）利于酶的分離純化；（5 5）安全可靠、無毒性。）安全可靠、無毒性。 1) 1)樣品的采集樣品的采集: :從富含該酶作用底物的場所采集樣品從富含該酶作用底物的場所采集樣品 2)2)富集培養(yǎng)富集培養(yǎng): : 投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pure culturepure culture）。）。 4)4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。 產(chǎn)酶微生物的分離和篩選產(chǎn)酶微生物的分離和篩選 - -淀粉酶的篩選淀粉酶的

37、篩選蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育 誘變育種誘變育種 原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合育種 基因工程育種基因工程育種 常見產(chǎn)酶微生物常見產(chǎn)酶微生物 Common Common microorganism in Enzyme Productionmicroorganism in Enzyme Productionn1 1、細(xì)菌、細(xì)菌n細(xì)菌是在工業(yè)上細(xì)菌是在工業(yè)上有重要應(yīng)用價(jià)值有重要應(yīng)用價(jià)值的原核微生物。的原核微生物。在酶的生產(chǎn)中常在酶的生產(chǎn)中常用的細(xì)菌有大腸用的細(xì)菌有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、枯草芽孢

38、桿菌等。桿菌等。常見產(chǎn)酶微生物常見產(chǎn)酶微生物 Common Common microorganism in Enzyme Productionmicroorganism in Enzyme Productionn1 1、細(xì)菌、細(xì)菌n細(xì)菌依細(xì)胞的形狀和分裂后的集合狀態(tài)而給予各細(xì)菌依細(xì)胞的形狀和分裂后的集合狀態(tài)而給予各種名稱。按形狀分為球菌、桿菌、螺旋菌等。球種名稱。按形狀分為球菌、桿菌、螺旋菌等。球菌又有單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、菌又有單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、鏈球菌、葡萄球菌等。鏈球菌、葡萄球菌等。 常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzym

39、e Production 球菌球菌 鏈球菌鏈球菌常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production 四聯(lián)球菌四聯(lián)球菌 葡萄球菌葡萄球菌常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production 桿菌桿菌 螺旋菌螺旋菌n形態(tài)：短桿或長桿狀，形態(tài)：短桿或長桿狀，0.51.01.03.0 um，革蘭氏，革蘭氏陰性，運(yùn)動陰性，運(yùn)動(周毛周毛)或不運(yùn)動，無芽孢，一般無莢膜。菌落或不運(yùn)動，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。nEscherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿

40、菌是無害，但個(gè)別大腸屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無害，但個(gè)別大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。n大腸桿菌易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長迅速，而且營養(yǎng)要求低。大腸桿菌易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長迅速，而且營養(yǎng)要求低。n產(chǎn)生的酶一般都屬于胞內(nèi)酶產(chǎn)生的酶一般都屬于胞內(nèi)酶應(yīng)用：應(yīng)用： 工業(yè)上生產(chǎn)工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等 大腸桿菌是最早用作大腸桿菌是最早用作基因工程的宿主基因工程的宿主菌菌 n細(xì)胞呈單個(gè)桿狀，周生細(xì)胞呈單個(gè)桿狀，周生或側(cè)生鞭毛，或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽革蘭氏陽性，無莢膜，

41、芽孢橢圓性，無莢膜，芽孢橢圓至柱狀菌落粗糙，不透至柱狀菌落粗糙，不透明，不閃光，擴(kuò)張，污明，不閃光，擴(kuò)張，污白色或微帶黃色。白色或微帶黃色。n枯草芽孢桿菌應(yīng)用最廣枯草芽孢桿菌應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶微生物。生產(chǎn)泛的產(chǎn)酶微生物。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶、5 5- -核苷酸酶、某些氨基酸核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。及核苷。n菌體從橢圓至桿狀，單個(gè)、菌體從橢圓至桿狀，單個(gè)、成對或成鏈，革蘭氏陰性，成對或成鏈，革蘭氏陰性，運(yùn)動（周毛）或不運(yùn)動，運(yùn)動（周毛）或不運(yùn)動，不生芽孢。好氣。含糖、不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長良好。生長良好。n應(yīng)用：有機(jī)酸應(yīng)用：有機(jī)酸(

42、 (食醋等）、食醋等）、葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶( (高果糖高果糖漿漿 ) )、山梨糖山梨糖 ( (維維C C中間中間體）體） 常用的產(chǎn)酶微生物常用的產(chǎn)酶微生物2、放線菌、放線菌(actinomycetes) n放線菌是具有分支狀菌絲的單細(xì)胞原核微生物。常用于酶放線菌是具有分支狀菌絲的單細(xì)胞原核微生物。常用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的放線菌主要是鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的放線菌主要是鏈霉菌( (StreptomycesStreptomyces) )。n鏈霉菌菌落呈放射狀，具有分枝的菌絲體，菌絲直徑鏈霉菌菌落呈放射狀，具有分枝的菌絲體，菌絲直徑0.20.21.2m1.2m。革蘭氏染色陽性。菌絲有氣生菌絲和基內(nèi)。革蘭氏染

43、色陽性。菌絲有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲之分，基內(nèi)菌絲不斷裂，只有氣生菌絲形成孢子鏈。菌絲之分，基內(nèi)菌絲不斷裂，只有氣生菌絲形成孢子鏈。n鏈霉菌是生產(chǎn)鏈霉菌是生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶的主要微生物。還可以用于生的主要微生物。還可以用于生產(chǎn)青霉素酰化酶、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、產(chǎn)青霉素?；浮⒗w維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。此外，鏈霉菌還含有豐富的幾丁質(zhì)酶等。此外，鏈霉菌還含有豐富的1616羥化酶，可羥化酶，可用于甾體轉(zhuǎn)化。用于甾體轉(zhuǎn)化。常用的產(chǎn)酶微生物常用的產(chǎn)酶微生物n放線菌放線菌n鏈霉菌屬 n諾卡氏菌屬A：諾爾斯氏鏈霉菌；B：皮疽諾卡氏菌；C：酒紅脂孢囊菌；D：游動放線菌；

44、E：小單胞菌；F：皺雙孢馬杜拉放線菌常用的產(chǎn)酶微生物常用的產(chǎn)酶微生物n放線菌放線菌 n諾卡氏菌屬n多為需氧型腐生菌，少數(shù)厭氧型寄生菌。已報(bào)道有100余種，主要分布于土壤。許多種能產(chǎn)生抗生素，如利福霉素（rifomycin）等，有的用于石油脫蠟，烴類發(fā)酵及污水處理等。常用的產(chǎn)酶微生物常用的產(chǎn)酶微生物n放線菌放線菌n鏈霉菌屬n主要分布于含水量較低，有機(jī)質(zhì)豐富的中性或微堿性土壤中，多數(shù)為腐生，好氧菌。已知放線菌所產(chǎn)抗生素的90由本屬產(chǎn)生。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn3 3、霉菌、霉菌n霉菌是一類絲狀真菌。霉菌是一類絲狀真菌。用于

45、酶的發(fā)酵生產(chǎn)的用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)的霉菌主要有黑曲霉、霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、紅曲霉、青米曲霉、紅曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉、木霉、根霉、毛霉等。霉等。n分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門。少數(shù)屬于半知菌亞門。n分布：廣泛分布于土壤、空氣分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。生致癌性的黃曲霉毒素。n代表種：代表種：黑曲霉黑曲霉Asp. NigerAsp. Niger、黃曲霉黃曲霉Asp.flavusAsp.flavusn應(yīng)用：應(yīng)用：是制醬、釀酒、

46、制醋的是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種。產(chǎn)糖化飼料的菌種。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn黑曲霉黑曲霉n黑曲霉是曲霉屬黑曲霉群霉菌。菌絲體由具有橫黑曲霉是曲霉屬黑曲霉群霉菌。菌絲體由具有橫隔的分支菌絲構(gòu)成，隔的分支菌絲構(gòu)成， 菌叢黑褐色，頂囊大球形，菌叢黑褐色，頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子球形，平滑或粗糙。小梗雙層，

47、分生孢子球形，平滑或粗糙。n黑曲酶可用于生產(chǎn)多種酶，有胞外酶也有胞內(nèi)酶。黑曲酶可用于生產(chǎn)多種酶，有胞外酶也有胞內(nèi)酶。例如，例如， 糖化酶，糖化酶，-淀粉酶淀粉酶, , 酸性蛋白酶，果膠酸性蛋白酶，果膠酶，葡萄糖氧化酶，過氧化氫酶，核糖核酸酶，酶，葡萄糖氧化酶，過氧化氫酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纖維素酶等。脂肪酶，纖維素酶等。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn 米曲霉米曲霉( (Aspergillus oryzaeAspergillus

48、 oryzae) )n米曲霉是曲霉屬黃曲霉群霉菌。菌叢一般為黃綠米曲霉是曲霉屬黃曲霉群霉菌。菌叢一般為黃綠色，后變?yōu)辄S褐色，分生孢子頭呈放射形，頂囊色，后變?yōu)辄S褐色，分生孢子頭呈放射形，頂囊球形或瓶形，小梗一般為單層，分生孢子球形，球形或瓶形，小梗一般為單層，分生孢子球形，平滑，少數(shù)有刺，分生孢子梗長達(dá)平滑，少數(shù)有刺，分生孢子梗長達(dá)2mm2mm左右，粗糙。左右，粗糙。n米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力較強(qiáng)，這使米曲米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力較強(qiáng)，這使米曲霉在我國傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲的制造中廣泛應(yīng)用。霉在我國傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲的制造中廣泛應(yīng)用。此外，米曲霉還可以用于生產(chǎn)氨基?；浮⒘姿岽送?，米曲霉還

49、可以用于生產(chǎn)氨基?；?、磷酸二酯酶、果膠酶、核酸酶二酯酶、果膠酶、核酸酶P P等。等。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn紅曲霉（紅曲霉（MonascusMonascus）n紅曲霉菌落初期白色，成熟后變?yōu)榈凵⒆霞t紅曲霉菌落初期白色，成熟后變?yōu)榈凵⒆霞t色或灰黑色。通常形成紅色色素。菌絲具有隔膜，色或灰黑色。通常形成紅色色素。菌絲具有隔膜，多核，分枝甚繁。分生孢子著生在菌絲及其分枝多核，分枝甚繁。分生孢子著生在菌絲及其分枝的頂端，單生或成鏈，閉囊殼球形，有柄，其內(nèi)的頂端，單生或成鏈，閉囊殼球形，有柄，其內(nèi)散生十多個(gè)子囊，子囊球

50、形，內(nèi)含散生十多個(gè)子囊，子囊球形，內(nèi)含8 8個(gè)子囊孢子，個(gè)子囊孢子，成熟后子囊壁解體，孢子則留在閉囊殼內(nèi)。成熟后子囊壁解體，孢子則留在閉囊殼內(nèi)。n紅曲霉可用于生產(chǎn)紅曲霉可用于生產(chǎn)-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶等。蛋白酶等。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn青霉(Penicillium)n青霉屬半知菌綱。其營養(yǎng)菌絲體無色、淡色或具有鮮明的顏色，有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，光滑或粗糙，頂端形成帚狀分枝，小梗頂端串生分生孢子，分生孢子球形、橢圓形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生長時(shí)呈藍(lán)綠色。有少數(shù)種會產(chǎn)生

51、閉囊殼，其內(nèi)形成子囊和子囊孢子，亦有少數(shù)菌種產(chǎn)生菌核。n青霉菌種類很多，其中產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum ）用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素）果膠酶、纖維素酶等。桔青霉（Penicillium cityrinum）用于生產(chǎn)5-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。 常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn木霉(Trichoderma)n木霉屬于半知菌綱。生長時(shí)菌落生長迅速，呈棉絮狀或致密叢束狀，菌落表面呈不同程度的綠色，菌絲透明，有分隔，分枝繁復(fù)

52、，分枝上可繼續(xù)分枝，形成二級分枝、三級分枝，分支末端為小梗，瓶狀，束生、對生、互生或單生，分生孢子由小梗相繼生出，靠粘液把它們聚成球形或近球形的孢子頭。分生孢子近球形、橢圓形、圓筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或亮黃綠色。n木霉是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。木霉生產(chǎn)的纖維素酶中包含有C1酶、Cx酶和纖維二糖酶等。此外，木霉中含有較強(qiáng)的17 -羥化酶，常用于甾體轉(zhuǎn)化。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn 根霉(Rhizopus)n根霉生長時(shí),由營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的頂端膨大形成

53、孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)生孢子囊包子。孢子呈球形、卵形或不規(guī)則形狀。根霉可用于生產(chǎn)糖化酶、-淀粉酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。根霉有強(qiáng)的11-羥化酶，是用于甾體轉(zhuǎn)化的重要菌株。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn毛霉(Mucor)n毛霉的菌絲體在基質(zhì)上或基質(zhì)內(nèi)廣泛蔓延，無假根。菌絲體上直接生出孢子囊梗，一般單生，分枝較少或不分枝。孢子囊梗頂端都有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常有針狀的草酸鈣結(jié)晶。n毛霉常用于生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。 常見產(chǎn)酶微生物 Common mi

54、croorganism in Enzyme Productionn4、酵母、酵母酵母是一群屬于真菌的單細(xì)酵母是一群屬于真菌的單細(xì)胞微生物。它分為兩大類胞微生物。它分為兩大類: : 一類能產(chǎn)生子囊孢子，稱為一類能產(chǎn)生子囊孢子，稱為真酵母；另一類不能生成子真酵母；另一類不能生成子囊孢子，稱為類酵母。通常囊孢子，稱為類酵母。通常以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，也有少數(shù)酵母進(jìn)行有性繁殖。也有少數(shù)酵母進(jìn)行有性繁殖。細(xì)胞形狀因菌株而異，有球細(xì)胞形狀因菌株而異，有球形、卵園形、檸檬形、梨形、形、卵園形、檸檬形、梨形、臘腸形、也有絲狀。大小一臘腸形、也有絲狀。大小一般為般為1 130m30m。

55、 常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Productionn啤酒酵母啤酒酵母( (Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae) )n啤酒酵母是啤酒工業(yè)上廣泛應(yīng)用的酵母。細(xì)胞啤酒酵母是啤酒工業(yè)上廣泛應(yīng)用的酵母。細(xì)胞由圓形、卵形、橢圓形到臘腸形。在麥芽汁培由圓形、卵形、橢圓形到臘腸形。在麥芽汁培養(yǎng)基上，菌落為白色，有光澤，平滑，邊緣整養(yǎng)基上，菌落為白色，有光澤，平滑，邊緣整齊。營養(yǎng)細(xì)胞可以直接變?yōu)樽幽?，每個(gè)子囊含齊。營養(yǎng)細(xì)胞可以直接變?yōu)樽幽?，每個(gè)子囊含有有1 14 4個(gè)圓形光亮的子囊孢子。個(gè)圓形光亮的子

56、囊孢子。n啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒類的生產(chǎn)外，啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒類的生產(chǎn)外，還可以用于轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶還可以用于轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等的生產(chǎn)。等的生產(chǎn)。常見產(chǎn)酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production假絲酵母假絲酵母( (CandidaCandida) )n假絲酵母的細(xì)胞圓形，卵形或長形。無性繁殖假絲酵母的細(xì)胞圓形，卵形或長形。無性繁殖為多邊芽殖，形成假菌絲，也有真菌絲，可生為多邊芽殖，形成假菌絲，也有真菌絲，可生成無節(jié)孢子、子囊孢子、冬孢子或擲孢子。不成無節(jié)孢子、子囊孢子、冬孢子或擲孢子。不產(chǎn)生色素。在麥

57、芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈乳產(chǎn)生色素。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色或奶油色。白色或奶油色。n假絲酵母可以用于生產(chǎn)脂肪酶、尿酸酶、尿囊假絲酵母可以用于生產(chǎn)脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等。具有較強(qiáng)的素酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等。具有較強(qiáng)的17-17-羥基化酶，可以用于甾體轉(zhuǎn)化。羥基化酶，可以用于甾體轉(zhuǎn)化。2.3 酶的發(fā)酵工藝條件與控制酶的發(fā)酵工藝條件與控制 The fermentation principles and its control of enzyme production微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的一般工藝流程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的一般工藝流程 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)保藏細(xì)胞細(xì)胞活化發(fā)酵 分離純化酶

58、 固定化細(xì)胞 原生質(zhì)體 固定化原生質(zhì)體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)無菌空氣菌種篩選菌種篩選搖瓶試驗(yàn)搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)2、培養(yǎng)基3、發(fā)酵條件及控制GoGo1、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)Gon選育得到的優(yōu)良產(chǎn)酶微生物必須采取妥善的方法選育得到的優(yōu)良產(chǎn)酶微生物必須采取妥善的方法進(jìn)行保藏。常用的保藏方法有：進(jìn)行保藏。常用的保藏方法有：n斜面保藏法；斜面保藏法；n沙土管保藏法；沙土管保藏法；n真空冷凍干燥保藏法；真空冷凍干燥保藏法；n低溫保藏法；低溫保藏法；n石蠟油保藏法等石蠟油保藏法等 可以根據(jù)需要和可能進(jìn)行選擇，以盡可能?？梢愿鶕?jù)需要和可能進(jìn)行選擇，以盡可能保持細(xì)胞的生長、繁殖和產(chǎn)酶特性。持細(xì)胞的生長、繁殖和產(chǎn)酶

59、特性。1、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)n（1 1）低溫保藏）低溫保藏 n一般用斜面保藏，用合適的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，一般用斜面保藏，用合適的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，置低溫（置低溫（3 355）保存。）保存。n一般霉菌、放線菌、芽孢桿菌可保藏一般霉菌、放線菌、芽孢桿菌可保藏半年半年左右，左右，n酵母約酵母約3 3個(gè)月個(gè)月左右，左右，n而無芽孢細(xì)菌或有些微生物則低溫保藏時(shí)間不宜而無芽孢細(xì)菌或有些微生物則低溫保藏時(shí)間不宜長久，否則移植后難于繁殖。長久，否則移植后難于繁殖。n為了防止移植過于頻繁而引起退化，應(yīng)一次多移為了防止移植過于頻繁而引起退化，應(yīng)一次多移植一些斜面，供一段時(shí)間生產(chǎn)之需。植一些斜面

60、，供一段時(shí)間生產(chǎn)之需。 n（2 2）砂土保藏法）砂土保藏法 n將細(xì)砂通過將細(xì)砂通過40406060目，用目，用1010鹽酸浸洗鹽酸浸洗2 h2 h，水洗，水洗至中性，烘干后取肥沃土壤與砂按至中性，烘干后取肥沃土壤與砂按1 1：2 2（質(zhì)量比）（質(zhì)量比）混合，分裝入安瓿（混合，分裝入安瓿（b b）管內(nèi)）管內(nèi)2 23 cm3 cm高，裝上高，裝上棉塞后在棉塞后在121 30 min121 30 min，滅菌，滅菌3 3次，經(jīng)滅菌檢查合次，經(jīng)滅菌檢查合格后，將新長好的斜面菌落刮下加無菌水做成懸格后，將新長好的斜面菌落刮下加無菌水做成懸液，用無菌吸管滴入砂土中使之潤濕，再置氯化液，用無菌吸管滴入砂土中