解磷微生物研究進展

1、解磷微生物研究進展鄭琨n蘇北鹽堿灘涂土壤概況n解磷微生物的種類與分布n解磷微生物的分離篩選n解磷機制n解磷能力的測定n技術路線探討一 蘇北鹽堿灘涂土壤概況 江蘇沿海灘涂資源總面積約65.24104 平方公里，由潮上帶(25.98104平方公里)、潮間帶(26.57104平方公里)及輻射沙脊群的出露沙洲(12.69104平方公里)組成。江蘇海岸由砂質海岸、基巖海岸、和淤泥質海岸組成，以粉沙淤泥質海岸為主，占全省海岸線長度的90.5 江蘇海岸帶地勢開闊，土壤類型單調(diào)，海堤以外主要分布濱海鹽土類，堤內(nèi)老墾區(qū)分布潮土類。潮間帶的土壤為濱海鹽土(海堤外至零米線的地區(qū))，分為潮灘鹽土、草甸海濱鹽土和沼澤海

2、濱鹽土三個亞類。 一般來說，從潮灘鹽土到沼澤海濱鹽土， 土壤呈現(xiàn)含鹽量逐漸降低，有機質含量逐漸升高的趨勢。 開發(fā)利用沿海灘涂土壤是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分迫切和重要的任務。隨著耐鹽作物育成和耐鹽經(jīng)濟植物發(fā)現(xiàn) ，這些植物的營養(yǎng)狀況將成為今后解決的問題。 鹽堿土壤的另一特點是可溶性有效磷含量低，絕大部分以難溶性磷酸鹽形式存在。而且鹽堿土壤一般無機鹽豐富，有機質嚴重缺乏，土壤板結，不宜施無機肥。 我國每年1/3的磷肥需要進口，復合肥料和微生物肥料使用率不到30%（發(fā)達國家達到50%）。 土壤中的解磷微生物，可將土壤中難溶磷酸鹽轉化為植物易吸收的可溶性磷，這為改善鹽土植物營養(yǎng)狀況提供了出路。二 解磷微生物的

3、種類與分布 解磷微生物(Phosphate-solubilizing microoganism，PSM)是一類能夠將植物難以吸收的磷轉化為可利用狀態(tài)的微生物，這類解磷微生物除了可以活化土壤中難溶性的磷外，還可以通過影響植物根系分泌物的種類和數(shù)量，以增加植物根系對周圍K,Ca,Mg,Fe,Zn等營養(yǎng)元素的吸收，使植物能夠適應鹽堿缺磷的環(huán)境。 人們在20世紀初開始注意到微生物與土壤磷之間的關系。Sackett(1908)發(fā)現(xiàn)一些難溶性的復合物施入土壤中，可以被作為磷源而應用，他們從土壤中篩選出50株細菌，其中36株在平板上形成了肉眼可見的溶磷圈。1948年Gerretsen發(fā)現(xiàn)植物施入不溶性的磷肥

4、，經(jīng)接種土壤微生物后，促進了植株的生長，增加磷的吸收。他分離出了這些微生物，發(fā)現(xiàn)這些微生物可幫助磷礦粉的溶解。從此許多科學家致力于解磷菌的研究，相繼報道了許多微生物具有解磷作用。 解磷微生物(PSM)包括細菌、真菌和放線菌。 目前報道的解磷細菌解磷細菌主要有芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃桿菌屬(Flavobacterium )、腸細菌屬 (Enterbacter)、微球菌屬(Micrococcus)、固氮菌屬(A

5、zotobacter)、沙門氏菌屬(Salmonella)、色桿菌屬(Chromobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、節(jié)細菌屬(Arthrobacter)、硫氧化硫功菌(Thiobacillus thivoxidans)和多硫桿菌屬(Thiobacillus)等。 解磷真菌解磷真菌主要是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和根霉屬(Rhizopus )。 而解磷放線菌解磷放線菌則絕大部分為鏈霉菌屬(Streptomyces)。 按分解底物可以將解磷微生物分為兩類：一類是能夠分解無機磷化合物的稱為無機磷微生物無機磷微生物(包括假單孢菌屬的一些種

6、，無色桿菌屬的一些種，黃桿菌屬的一些種以及氧化硫硫桿菌); 一類是具有分解有機磷化合物能力的稱為有有機磷微生物機磷微生物（包括芽孢桿菌屬的一些種，變形菌屬的一種，沙雷氏菌屬的一些種）。 但由于解磷微生物解磷機理復雜，相當一部分的解磷既能分泌有機酸溶解無機磷鹽，又能分泌磷酸酶物質分解有機磷（包括節(jié)桿菌屬的一些種、鏈霉菌屬的一些種），因而很難準確區(qū)分無機磷和有機磷微生物。 解磷微生物的分布表現(xiàn)出明顯的根際效根際效應應，主要表現(xiàn)在：根際土壤中的數(shù)量明顯高于非根際土壤。 解磷菌表現(xiàn)出的強根際效應可能與根圈磷素營養(yǎng)虧缺誘導有關，但由于根圈微生物的群落結構受根系分泌物及根脫落物的影響，導致不同植物根圈微生

7、物的組成差別很大，這種作用也影響解磷菌的群落組成。 同時，不同的植被類型和不同的生態(tài)環(huán)境中，土壤解磷微生物的數(shù)量，種類及菌群結構也不同。 林啟美(2000) 等調(diào)查農(nóng)田、林地、草地和菜地等4種不同土壤生態(tài)環(huán)境中解磷菌數(shù)量和種群結構時，發(fā)現(xiàn)前3種土壤中的有機磷細菌只有菜地土壤的110，但農(nóng)田土壤中解磷細菌的總數(shù)所占比例并不低。耕地土壤有機解磷菌主要是芽孢桿菌屬，林地和菜地則主要是假單胞桿菌屬；無機磷細菌種類比較少。三 解磷微生物的分離篩選 目前，分離解磷微生物的方法一般是根據(jù)在以磷酸三鈣為唯一磷源的平板上產(chǎn)生透明圈來確定。 例如真菌無機磷培養(yǎng)基：蔗糖2g、葡萄糖2 g、NH4Cl 1.5g、KC

8、l 0.3g、MgSO4 .7H2O 0.4g、NaCl 0.2g、磷酸鈣20g，蒸餾水1000 mL，pH7.0。 如果篩選耐鹽解磷菌株，則需要根據(jù)實地鹽濃度在培養(yǎng)基中添加NaCl。 解磷微生物的篩選就是在分離出的具有解磷能力的所有菌株中篩選出具有最強解磷能力的菌株。 一般來說要以該解磷微生物將要應用的實際環(huán)境作為篩選實驗的條件，即在與應環(huán)境相同的溫度，pH值，鹽度等條件下培養(yǎng)解磷微生物，以解磷能力最強（一般以培養(yǎng)基中有效磷含量最高為標準）的菌株作為最優(yōu)選擇。四 解磷機制解磷微生物溶解難溶性磷化物的機制可歸結為以下幾類:(1) 通過生命代謝活動產(chǎn)生有機酸(細菌一般分泌乳酸、氨基酸、草酸、延胡

9、索酸和檸檬酸等，真菌主要分泌草酸、丙二酸和乳酸等)，這些酸一方面直接溶解土壤中難溶性磷酸鹽，另一方面則是通過鰲合作用釋放出土壤磷素。(2)由NH4+同化作用放出質子降低pH值，引起磷酸鹽溶解。(3)通過呼吸作用放出C02，降低環(huán)境pH值，從而引起磷酸鹽的溶解。(4)磷細菌釋放H2S，與磷酸鐵進行化學反應產(chǎn)生硫酸亞鐵和可溶性磷酸鹽。(5)腐解植物殘體而產(chǎn)生胡敏酸和富里酸。這兩種酸能與復合磷酸鹽中的鈣、鐵鰲合，從而釋放出磷酸根。它們也能與鐵、鋁及磷酸鹽形成穩(wěn)定的可溶性復合物，這些復合物可以被植物吸收利用。(6)微生物對鈣離子的吸收，使磷酸根離子進入土壤溶液。(7)生物礦化作用。即通過分泌植酸酶、核

10、酸酶和磷酸酶等物質，將磷酸脂等有機磷降解。五 解磷能力的測定 解磷能力是表征解磷微生物作用的重要指標，可采用定性法和定量法兩種方法測定。 定性法定性法一般指的是平板溶磷圈法; 平板溶菌圈法:將溶磷菌株在含有難溶性磷酸鹽或有機磷的固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定周圍菌落產(chǎn)生透明圈的大小。無機磷平板一般采用磷磷酸鈣鹽固體培養(yǎng)基酸鈣鹽固體培養(yǎng)基，接種菌株培養(yǎng)數(shù)天后，以磷酸鈣鹽平板上菌落周圍出現(xiàn)透明圈的視為有解無機磷能力的菌株。有機磷平板一般采用卵黃平板卵黃平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基，以卵黃平板上菌落周圍出現(xiàn)混濁圈的視為有解有機磷能力(卵磷脂被水解形成脂肪和磷酸)。 溶磷圈直徑（D）和菌落生長直徑(d)的比值(D/d

11、)是表征解磷菌相對解磷能力的一個指標。 定量法定量法包括液體培養(yǎng)法、土培法、砂培法和同位素示蹤法。 液體培養(yǎng)法:將含解磷微生物和不溶性磷化物(如Ca3(P04)2)的培養(yǎng)液和對照(不含解磷微生物)培養(yǎng)一定時間后，測定培養(yǎng)液中可溶性磷的含量。但在液體培養(yǎng)法中如何將溶磷菌分解的無機磷浸提出來并加以測定，不同的研究者采用的方法不同，總的可分為:培養(yǎng)液過濾法，離心取上清液法，熏蒸、消煮法等。對處理后的培養(yǎng)液中磷含量一般都采用鉬鉬藍比色法藍比色法測定，其原理是利用一定的酸度條件下，加鉬酸銨于含磷的溶液中，溶液中的正磷酸與鉬酸絡合形成磷鉬雜多酸。H3PO4+12H2MoO4=H3PMo12O40+12H2

12、O 在適宜試劑濃度下，加入適當?shù)倪€原劑(如抗壞血酸)，使磷鉬酸中的一部分Mo6+離子被還原為Mo5+，生成一種叫做“鉬藍”的物質，當將含不溶性無機磷的培養(yǎng)液經(jīng)鉬磷試劑處理后，培養(yǎng)液發(fā)生顯色反應，通過比色法間接求出培養(yǎng)液中水溶性磷的含量。 土培(或砂培)法:一般是通過接種解磷菌株到培養(yǎng)植物的土壤(或砂土)中，以不接種解磷菌的植株為對照，通過測定土壤浸提液中有效磷的含量來評定解磷菌株的解磷能力。砂培法通常也結合同位素示蹤法使用。 同位素示蹤法:在含標記有32P的不溶性磷化合物(有機磷或無機磷)的培養(yǎng)基內(nèi)接種供試菌株，使菌體在培養(yǎng)過程中吸收32P，再用含32P的菌體(以含32P的不接種菌株培養(yǎng)基為對

13、照)培育植物幼苗，測定該植株由標記的菌體內(nèi)吸入的32P量比對照樣處理的增加量，即為該菌體的解磷量。六 技術路線探討蘇北鹽堿灘涂土壤解磷微生物的分離篩選高效解磷菌的鑒定高效解磷菌的鑒定高效解磷菌最佳培養(yǎng)條件高效解磷菌最佳培養(yǎng)條件高效解磷菌劑高效解磷菌劑分子鑒定分子鑒定 傳統(tǒng)真菌菌種鑒定方法主要以形態(tài)學為依據(jù)，即通過培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)和個體顯微特征，將菌種鑒定到綱、門、科、屬、種。然而真菌的形態(tài)特征復雜，且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，因此，在傳統(tǒng)的真菌分類中常引起分類系統(tǒng)的不穩(wěn)定或意見分歧。 在真菌的現(xiàn)代分類學中引入了分子生物學技術鑒定方法，可以使菌種的鑒定在以形態(tài)特征和生理

14、生化特征為基礎的鑒定上更加準確、可靠。 目前用于未知菌分類鑒定的核酸序列分析最常選用的目的片段是rDNA。真菌基因組中編碼核糖體的基因包括4種，28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它們在染色體上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。 間隔區(qū)是位于核糖體大小亞基基因之間的核苷酸序列。位于28S rDNA的3 端與18S rDNA的5 端之間的序列稱為核糖體內(nèi)轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers，ITS)，ITS1位于18S rDNA和58S rDNA之間，ITS2位于5.8S rDNA和28S rDNA之間(見圖1) rDN

15、A是核基因組中的序列，受到細胞核中保護機制的保護，同時具有多變區(qū)和保守區(qū)，利用其保守區(qū)可以研究高級分類階元關系，而利用多變區(qū)則也可研究種和種下關系。 如核糖體DNA中18S，5.8S和28S的基因組序列在大多數(shù)生物中趨于保守，在生物種間變化小，而內(nèi)轉錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，相對變化較大，并且能夠提供詳盡的系統(tǒng)學分析所需要的可遺傳性狀。(技術路線)發(fā)酵條件優(yōu)化發(fā)酵條件優(yōu)化 發(fā)酵條件優(yōu)化一般分為兩步：第一步確定各個培養(yǎng)因子的最佳種類，第二部確定各個最佳因子的最佳水平。 第一步一般采用分別確定各因子最佳種類的方法。例如，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，選用同一水平的不同碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，糖蜜，小麥麩皮等）培養(yǎng)微生物，根據(jù)結果（如菌體鮮重，解磷能力等）選擇出最佳碳源。第二步一般采用正交實驗的方法。 正交試驗設計(Orthogonal experimental design)是研究多因素多多因素多水平水平的又一種設計方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，正交試驗設計是是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設計方法。 雅致放射毛霉液體深層培養(yǎng)條件及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究