流式細胞儀的熒光補償問題

1、 1.熒光素為什么會出現(xiàn)熒光？ 2.檢測前為什么需要進行熒光補償？ 3.熒光補償?shù)姆椒ㄓ心男?4.熒光補償?shù)脑瓌t是什么？熒光發(fā)生的機理 室溫下熒光素分子大部分處于“基態(tài)”，當(dāng)熒光素在一定波長（激發(fā)波長）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色后的細胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級躍遷，進入新的狀態(tài)，稱為“激發(fā)態(tài)”，處于激發(fā)態(tài)的分子極不穩(wěn)定，它可以通過在10-910-7秒的極短時間內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。熒光素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個特征光譜 激發(fā)光譜（Excitation，Ex）： 是指能特異

2、性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。 吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max 發(fā)射光譜（Emission）： 是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。 發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max發(fā)射波峰-最大發(fā)射波長FITC-異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素PE-藻紅蛋白藻紅蛋白PE-Cy5-藻紅蛋白偶聯(lián)物藻紅蛋白偶聯(lián)物熒光染色對照的設(shè)置 陰性對照 空白對照（自發(fā)熒光） 同型（ISO)對照（自發(fā)熒光非特異熒光）實驗樣本（特異熒光自發(fā)熒光）熒光染料平均熒光強度比較熒光染料平均熒光強度比較 PerCP APC FITC ECD PC5 PE同型對照的選擇與實驗染色的單

3、克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型；與染色的單克隆抗體 相同種屬來源 相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標(biāo)記 相同劑量和濃度分析類型管功能 加入的抗體單色分析1Isotype1-FITC2Sample1,2A-FITC雙色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PE三色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- PC54Compensati

4、on31-FITC2a-PEC-PC55Sample1,2A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-ECD1- PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- ECD1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- ECD1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC- ECD1- PC55Compensation41-FITC2a-PE1- ECDD-PC56Sample1,2A-FITCB-PEC-ECDD-PC5熒光補償（compensation）定義：指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（s

5、pectral overlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。 補償方法手動補償自動補償（flow-set)無論手動或自動補償都需將單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體分別進行單色熒光染色即幾色分析就需要制備幾個補償對照管現(xiàn)舉例進行FITC、PE、PC5三色手動補償1.準(zhǔn)備ISO（陰性對照管）； IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC52.通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群體落在雙陰性區(qū)域； FITC與PE、FITC與PC5、PE與PC5FITC FITC與PE PE3.上單染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，準(zhǔn)備補償；（注：保持電壓絕對不變；開始補償前，將原補償全部歸零；）調(diào)節(jié)補償原則 橫平豎直 即X-mean或Y-mean相等雙色熒雙色熒光補償光補償1雙色熒雙色熒光補償光補償2 雙陰雙陽單陽CD3