基因工程菌的穩(wěn)定性

1、基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策 基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn) 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性， 這種 不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式： 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 重組 DNA 分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表 觀生物學(xué)功能的喪失 分配不穩(wěn)定性 整個重組 DNA 分子從受體細胞中逃逸（curing）基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制 受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA 分子的降解 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝 能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生 應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)

2、閉合成途徑，啟動降解程序 重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配 這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因 受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制 受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA 分子的降解 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝 能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生 應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序 重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配 這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因 受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排重組質(zhì)粒的逃逸率 當含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些

3、空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。 重組質(zhì)粒逃逸的原因有： 高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料促使重 組質(zhì)粒滲漏 受體細胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質(zhì)?？截?數(shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇 影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素 載體的選擇 遺傳特性 宿主的選擇 外源基因整合到宿主染色體上 培養(yǎng)基 生長速率 發(fā)酵工藝 限制性基質(zhì) 溫度 pH 和溶氧 外源基因表達 提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 改進載體受體系統(tǒng) 以增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括： 將 R1 質(zhì)粒上的 parB 基因引入表達型載體中 其表達產(chǎn)物可以選擇性地

4、殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞 正確設(shè)置載體上的多克隆位點 禁止 DNA 片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi) 將受體細胞的致死性基因安裝在載體上 同時構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的 ssb 基因 （DNA 單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）培養(yǎng)基 一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性 微生物在含有有機氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復(fù)合培 養(yǎng)基中培養(yǎng)時，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸和其他物質(zhì)， 微生物的生長較在基本培養(yǎng)基中快。 比生長速率 基因重組菌的比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響。提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。 基因重組菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度，pH，溶氧，限制性

5、營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定的溫度和 pH 下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率的主要因素。限制性基質(zhì) 一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會受到一種或幾種物質(zhì)的限制。限制性基質(zhì)的種類對重組菌有不同的影響pH 和溶解氧 pH 和溶氧影響重組酵母菌的穩(wěn)定性。 pH 和溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時，通常都需要維持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。外源基因的表達 外源基因的表達會引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定

6、 外源基因高效表達時，有可能因競爭利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細胞的正常代謝活動，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定。 例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操縱子阻遏物的部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌 MV12（pVH5）時，在培養(yǎng)基中加入不同量的 IAA，發(fā)現(xiàn)隨 IAA 量的增加，pVH5 帶有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表達水平有很大提高，同時比生長速率下降，培養(yǎng)液中 Trp 的比例上升。電泳分析表明 60%70% 色氨酸合成能力喪失是由于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化，其余是由于質(zhì)粒丟失造成。提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 施加選擇壓力 根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素 藥物和食品生產(chǎn)時禁止使

7、用抗生素 加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間 添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力 載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份 培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 分階段控制培養(yǎng) 因外源基因表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制 在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達造成不穩(wěn)定性問 題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表 達。 連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng)，如在第一級進行生長，維持菌 體的穩(wěn)定性，在第二級進行表達。提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 控制目的基因的過量表達 使用可控型啟

8、動子控制目的基因的定時表達及表達程度 使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù) 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 工程菌的培養(yǎng)條件對其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大 可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH 和溶解氧濃度。 有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用 間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì) 粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提 高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 培養(yǎng)基組成：限

9、制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 控制培養(yǎng)條件 有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 例如研究表達干擾素 a 的大腸桿菌 W3110(pEC901) 在不同比生長速率下的質(zhì)粒穩(wěn)定性，隨著稀釋率的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價也明顯增大.提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 固定化 固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性 基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及

10、目的產(chǎn)物的 表達率都有了很大提高。 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì) 粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而采用固定化方法 后，這種選擇壓力則可被省去。 不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式二、基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有： 分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限 半連續(xù)培養(yǎng)（補料分批） 在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細胞進一步的 生長，或得到更多的代謝產(chǎn)物 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。 連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究。 透析培養(yǎng) 固定化

11、培養(yǎng)補料分批培養(yǎng) 補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。 在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補料的流加速率。連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對基因表達的影響等創(chuàng)造了良好的條件。 但是由于基因工程

12、菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開，進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在這樣的系統(tǒng)中關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細胞比生長速率。優(yōu)化這三個參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進入第二階段后可獲得最高表達水平或最大產(chǎn)率。透析培養(yǎng) 透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。 采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補充養(yǎng)

13、分而維持較合適的基質(zhì)濃度，從而獲得高密度菌體。 膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時間段都對產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響。固定化培養(yǎng) 基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展。 應(yīng)用發(fā)酵罐來大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。為了防止工程菌丟失攜帶的質(zhì)粒，保持基因工程菌的遺傳特性，因而對發(fā)酵罐的要求十分嚴格。由于生化工程學(xué)和計算機的發(fā)展，新型自動化發(fā)酵罐完全能滿足這些要求。

14、常規(guī)的微生物發(fā)酵設(shè)備可直接用于基因工程菌的培養(yǎng)。不同點在于，微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級或次級代謝產(chǎn)物，細胞生長并非主要目標。 基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)是相對獨立于細胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細胞并不需要的蛋白質(zhì)，因此，培養(yǎng)設(shè)備以及設(shè)備控制應(yīng)滿足獲得高濃度的受體細胞和高表達的基因表達產(chǎn)物。 發(fā)酵罐的組成部分有： 發(fā)酵罐體 保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、 精細的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、 空氣無菌過濾裝置 殘留氣體處理裝置 參數(shù)測量與控制系統(tǒng)（如 pH、O2、CO2 等） 培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。 基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中要求 環(huán)境條件恒定，不影響其遺傳特性，更不能引起所帶質(zhì)粒丟失。對發(fā)酵罐有特殊要求 如要提供菌體生長的最適條件