基因工程菌的穩(wěn)定性

1、基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策 基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn) 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質粒的不穩(wěn)定性， 這種 不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式： 結構不穩(wěn)定性 重組 DNA 分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表 觀生物學功能的喪失 分配不穩(wěn)定性 整個重組 DNA 分子從受體細胞中逃逸（curing）基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產生機制 受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA 分子的降解 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝 能量、物質的匱乏和外源基因表達產物的毒性誘導受體細胞產生 應激反應：關

2、閉合成途徑，啟動降解程序 重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配 這是重組質粒逃逸的基本原因 受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產生機制 受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA 分子的降解 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝 能量、物質的匱乏和外源基因表達產物的毒性誘導受體細胞產生 應激反應：關閉合成途徑，啟動降解程序 重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配 這是重組質粒逃逸的基本原因 受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排重組質粒的逃逸率 當含有重組質粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質粒，這些

3、空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為重組質粒的宏觀逃逸率。 重組質粒逃逸的原因有： 高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料促使重 組質粒滲漏 受體細胞中的核酸酶降解重組質粒 重組質粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質粒拷貝 數(shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇 影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素 載體的選擇 遺傳特性 宿主的選擇 外源基因整合到宿主染色體上 培養(yǎng)基 生長速率 發(fā)酵工藝 限制性基質 溫度 pH 和溶氧 外源基因表達 提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 改進載體受體系統(tǒng) 以增加質粒穩(wěn)定性為目的的構建方法包括： 將 R1 質粒上的 parB 基因引入表達型載體中 其表達產物可以選擇性地

4、殺死由于分配不均勻所產生的無質粒細胞 正確設置載體上的多克隆位點 禁止 DNA 片段插在穩(wěn)定區(qū)內 將受體細胞的致死性基因安裝在載體上 同時構建條件致死性的相應受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的 ssb 基因 （DNA 單鏈結合蛋白編碼基因）培養(yǎng)基 一些基因重組菌在復合培養(yǎng)基中顯示較高的質粒穩(wěn)定性 微生物在含有有機氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復合培 養(yǎng)基中培養(yǎng)時，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸和其他物質， 微生物的生長較在基本培養(yǎng)基中快。 比生長速率 基因重組菌的比生長速率對質粒穩(wěn)定性有很大影響。提高比生長速率有助于提高質粒穩(wěn)定性。 基因重組菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關，如溫度，pH，溶氧，限制性

5、營養(yǎng)物質濃度，有害代謝產物濃度等。在一定的溫度和 pH 下，限制性基質濃度往往是決定比生長速率的主要因素。限制性基質 一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經過一段時間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會受到一種或幾種物質的限制。限制性基質的種類對重組菌有不同的影響pH 和溶解氧 pH 和溶氧影響重組酵母菌的穩(wěn)定性。 pH 和溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時，通常都需要維持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。外源基因的表達 外源基因的表達會引起重組質粒的不穩(wěn)定

6、 外源基因高效表達時，有可能因競爭利用物質、能量、核糖體等干擾宿主細胞的正常代謝活動，并造成質粒不穩(wěn)定。 例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操縱子阻遏物的部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌 MV12（pVH5）時，在培養(yǎng)基中加入不同量的 IAA，發(fā)現(xiàn)隨 IAA 量的增加，pVH5 帶有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表達水平有很大提高，同時比生長速率下降，培養(yǎng)液中 Trp 的比例上升。電泳分析表明 60%70% 色氨酸合成能力喪失是由于質粒結構的變化，其余是由于質粒丟失造成。提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 施加選擇壓力 根據載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的抗生素 藥物和食品生產時禁止使

7、用抗生素 加入大量的抗生素會使生產成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間 添加抗生素選擇壓力對質粒結構不穩(wěn)定無能為力 載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的營養(yǎng)組份 培養(yǎng)基復雜，成本較高提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 分階段控制培養(yǎng) 因外源基因表達造成質粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制 在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達造成不穩(wěn)定性問 題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導外源基因表 達。 連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng)，如在第一級進行生長，維持菌 體的穩(wěn)定性，在第二級進行表達。提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 控制目的基因的過量表達 使用可控型啟

8、動子控制目的基因的定時表達及表達程度 使用可控型復制子控制質粒的定時增殖或降低質粒的拷貝數(shù) 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質粒的穩(wěn)定提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 工程菌的培養(yǎng)條件對其質粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大 可調控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH 和溶解氧濃度。 有些含質粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質粒的菌反應慢，因而采用 間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質 粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提 高質粒的穩(wěn)定性。 培養(yǎng)基組成：限

9、制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質粒的穩(wěn)定提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 控制培養(yǎng)條件 有些含質粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質粒的菌反應慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質粒的穩(wěn)定性。 例如研究表達干擾素 a 的大腸桿菌 W3110(pEC901) 在不同比生長速率下的質粒穩(wěn)定性，隨著稀釋率的增加，質粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價也明顯增大.提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略 固定化 固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性 基因重組大腸桿菌進行固定化后，質粒的穩(wěn)定性及

10、目的產物的 表達率都有了很大提高。 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質 粒的手段，往往在大規(guī)模生產中難以應用。而采用固定化方法 后，這種選擇壓力則可被省去。 不同的宿主菌及質粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式二、基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有： 分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限 半連續(xù)培養(yǎng)（補料分批） 在一次投料發(fā)酵的基礎上，流加一定量的營養(yǎng)，使細胞進一步的 生長，或得到更多的代謝產物 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。 連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學特性和穩(wěn)定性等研究。 透析培養(yǎng) 固定化

11、培養(yǎng)補料分批培養(yǎng) 補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng)，經過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。 在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結合起來，根據基因工程菌的生長規(guī)律來調節(jié)補料的流加速率。連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動力學、生理生化特性、環(huán)境因素對基因表達的影響等創(chuàng)造了良好的條件。 但是由于基因工程

12、菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開，進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在這樣的系統(tǒng)中關鍵的控制參數(shù)是誘導水平、稀釋率和細胞比生長速率。優(yōu)化這三個參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時質粒穩(wěn)定，菌體進入第二階段后可獲得最高表達水平或最大產率。透析培養(yǎng) 透析培養(yǎng)技術是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產物來解除其對生產菌的不利影響。 采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側循環(huán)，其另一側通入透析液循環(huán)，在補料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補充養(yǎng)

13、分而維持較合適的基質濃度，從而獲得高密度菌體。 膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時間段都對產物的產率有影響。固定化培養(yǎng) 基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術應用到這一領域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經固定化后，質粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展。 應用發(fā)酵罐來大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。為了防止工程菌丟失攜帶的質粒，保持基因工程菌的遺傳特性，因而對發(fā)酵罐的要求十分嚴格。由于生化工程學和計算機的發(fā)展，新型自動化發(fā)酵罐完全能滿足這些要求。

14、常規(guī)的微生物發(fā)酵設備可直接用于基因工程菌的培養(yǎng)。不同點在于，微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級或次級代謝產物，細胞生長并非主要目標。 基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產物。由于這類物質是相對獨立于細胞染色體之外的重組質粒上的外源基因所合成的、細胞并不需要的蛋白質，因此，培養(yǎng)設備以及設備控制應滿足獲得高濃度的受體細胞和高表達的基因表達產物。 發(fā)酵罐的組成部分有： 發(fā)酵罐體 保證高傳質作用的攪拌器、 精細的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、 空氣無菌過濾裝置 殘留氣體處理裝置 參數(shù)測量與控制系統(tǒng)（如 pH、O2、CO2 等） 培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。 基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中要求 環(huán)境條件恒定，不影響其遺傳特性，更不能引起所帶質粒丟失。對發(fā)酵罐有特殊要求 如要提供菌體生長的最適條件