【公開課課件】3.2基因工程的基本操作程序課件2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1、選擇性必修3第2節(jié)：基因工程的基本操作程序-1l 基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？l 基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？從社會中來 1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎?培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟?轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左)與非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(右)第一步：目的基因的篩選與獲取第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第四步：目的基因的檢測與鑒定培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉主要需要四個步驟：第一步：目的基因

2、的篩選與獲取第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第四步：目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的篩選與獲取1.目的基因定義在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀的或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。目的基因受體細(xì)胞目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因1.目的基因目的基因 Bt基因蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt基因伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)表達(dá)破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)殺死棉鈴蟲棉花細(xì)胞導(dǎo)入抗蟲棉培育2.篩選合適的目的基因基因海洋目的基因如何篩選相關(guān)的已經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因篩選篩選方法之一2.篩選合適的目的基因Bt基因的篩

3、選蘇云金桿菌制成殺蟲劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲發(fā)現(xiàn)殺蟲作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。2.篩選合適的目的基因篩選目的基因的技術(shù)手段測序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫(如GenBank)序列比對工具(如BLAST)測定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的工具。通過比對識別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因人工合成獲取目的基因的方法PCR擴(kuò)增常用方法我國首批轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育

4、使用PCR的含義 PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制。PCR的原理DNA復(fù)制所需的基本條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸PCR所需的基本條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用目的基因DNA4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)引物緩沖液Mg2+高溫使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的

5、模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈維持反應(yīng)體系的pH激活DNA聚合酶的活性引物引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為2030個核苷酸。在細(xì)胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。引物為DNA聚合酶提供了游離的3端，使DNA聚合酶從3端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)a.什么是引物b.引物的作用引物引物為DNA聚合酶提供了游離的3端，使DNA聚合酶從3端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)b.引物的作用5-35-3-53-引物引物子鏈延伸子鏈延伸引物是決定PCR特異性的關(guān)鍵。3-595PCR

6、的過程5-33-53-55-3第1步：變性當(dāng)溫度超過90時，雙鏈DNA解旋為單鏈。DNA模板4種脫氧核苷酸引物耐高溫的DNA聚合酶PCR的過程3-55-3第2步：復(fù)性當(dāng)溫度下降到50左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。503-55-5-3-5PCR的過程第3步：延伸當(dāng)溫度上升到72左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。723-55-35-3-53-3-55-5-3-5PCR的過程第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。3-55-35-3-53-5-3-53-3-53-5-3-

7、55-35-3-53-5-3-53-3-53-5-3-53-5-3-53-5-3-55-35-3-53-5-3-53-5-3-53-第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。5-3-53-3-53-5-3-55-35-3-53-Taq聚合酶引物1原料模板DNA目的基因3553引物2955072PCR過程(三輪擴(kuò)增)9550723553第一輪:高溫變性3553955072第一輪:低溫復(fù)性3553955072第一輪:中溫延伸3553955072第二輪:高溫變性3553955072第二輪:低溫復(fù)性3553955072第二輪:中溫延伸3553955072第三輪:高

8、溫變性3553955072第三輪:低溫復(fù)性3553955072第三輪:中溫延伸DNA解鏈為單鏈引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR的過程PCR過程可以在PCR擴(kuò)增儀(PCR儀)中自動完成。常采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定較小的DNA片段在凝膠中的移動相對容易，較大的DNA片段移動難。當(dāng)電泳結(jié)束時，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(標(biāo)準(zhǔn))，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。比較項(xiàng)目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化邊解旋邊復(fù)制DNA在高溫下變性解旋全部解旋后在復(fù)制場所主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(主

9、要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高溫的DNA聚合酶溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進(jìn)行結(jié)果合成整個DNA分子擴(kuò)增特定的DNA片段或基因聯(lián)系模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板原料:均為四種脫氧核苷酸酶:均需DNA聚合酶引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3端合成子鏈(2021(2021年北京卷年北京卷) )玉米是我國重要的農(nóng)作物，研究種子發(fā)育的機(jī)理對培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的玉米新品種具有重要作用。（1）玉米果穗上的每一個籽粒都是受精后發(fā)育而來。我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了甲品系玉米，其自交后的果穗上出現(xiàn)嚴(yán)重干癟且無發(fā)芽能力的籽粒，這種異常籽粒約占1/4。籽粒正常和干癟這一對相對性狀的遺傳遵

10、循孟德爾的_定律。上述果穗上的正常籽粒均發(fā)育為植株，自交后，有些植株果穗上有約1/4干癟籽粒，這些植株所占比例約為_ 。分離 2/3 （2）為闡明籽粒干癟性狀的遺傳基礎(chǔ)，研究者克隆出候選基因 A/a。將 A 基因?qū)氲郊灼废抵?，獲得了轉(zhuǎn)入單個A 基因的轉(zhuǎn)基因玉米。假定轉(zhuǎn)入的 A 基因已插入 a 基因所在染色體的非同源染色體上，請從下表中選擇一種實(shí)驗(yàn)方案及對應(yīng)的預(yù)期結(jié)果以證實(shí) “A 基因突變是導(dǎo)致籽粒干癟的原因”。 / （3）現(xiàn)已確認(rèn) A 基因突變是導(dǎo)致籽粒干癟的原因，序列分析發(fā)現(xiàn) a 基因是 A 基因中插入了一段 DNA（見圖 1），使 A 基因功能喪失。甲品系果穗上的正常籽粒發(fā)芽后，取其植株葉片，用圖 1 中的引物 1、2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，若出現(xiàn)目標(biāo)擴(kuò)增條帶則可知相應(yīng)植株的基因型為_。 Aa （4）為確定A基因在玉米染色體上的位置，借助位置已知的M/m基因進(jìn)行分析。用基因型為mm且籽粒正常的純合子P與基因型為MM的甲品系雜交得F1，F(xiàn)1自交得F2。用M、m 基因的特異性引物，對F1植株果穗上干癟籽粒（F2）胚組織的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果有1、2、3三種類型，如圖2所示。統(tǒng)計(jì)干癟籽粒（F2）的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)類型1最多、類型2