第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離,純化和表征

1、第五節(jié)第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離、純化和表征蛋白質(zhì)的分離、純化和表征一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)：一）蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)： 由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上及末端存在游離的氨基和游離的羧基，及末端存在游離的氨基和游離的羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)，因而也具有特定的等電點(diǎn)的性質(zhì)，因而也具有特定的等電點(diǎn)。（二）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)（二）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)(一一)茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)氨基酸與氨基酸與茚三酮茚三酮作用時(shí)，產(chǎn)生作用時(shí)，產(chǎn)生藍(lán)紫色藍(lán)紫色反應(yīng)，反應(yīng)，由于肽、蛋白質(zhì)是由許多

2、由于肽、蛋白質(zhì)是由許多氨基酸組成的，所以也氨基酸組成的，所以也呈此顏色反應(yīng)。呈此顏色反應(yīng)。(二二)雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在堿性溶液堿性溶液中與中與硫酸銅硫酸銅作用呈現(xiàn)作用呈現(xiàn)紫紅色紫紅色，稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個(gè)以上稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個(gè)以上CONH鍵的化合物都呈此反應(yīng)，肽和蛋白質(zhì)分子中氨基酸是鍵的化合物都呈此反應(yīng)，肽和蛋白質(zhì)分子中氨基酸是以肽鍵相連，因此，所有蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)以肽鍵相連，因此，所有蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。生反應(yīng)。OOHO2NH2-C-NH2NH2-C-N-C-NH2+NH3反應(yīng)名稱反應(yīng)名稱試試劑劑顏色顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)有此反

3、應(yīng)的有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨蛋白質(zhì)或氨基酸基酸雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫 色 或 粉紫 色 或 粉紅色紅色二個(gè)以上肽鍵二個(gè)以上肽鍵所有蛋白質(zhì)所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)米倫反應(yīng)H g N O3、H g ( N O3)2及及HNO3混合物混合物紅色紅色Tyr黃色反應(yīng)黃色反應(yīng)濃濃HNO3及及NH3黃 色 、 橘黃 色 、 橘色色Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)乙醛酸反應(yīng)(Hopking-Cole反反應(yīng)應(yīng))乙 醛 酸 試 劑 及乙 醛 酸 試 劑 及濃濃H2SO4紫色紫色Trp坂口反應(yīng)坂口反應(yīng)(Sakaguchi反應(yīng)反應(yīng))-萘酚、萘酚、NaClO紅色紅色胍基胍基Arg藍(lán)色藍(lán)色 OHN茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)茚

4、三酮茚三酮氨基及羧基氨基及羧基-氨基酸氨基酸（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)： 蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)1100nm1100nm，處于膠體顆粒的范圍。，處于膠體顆粒的范圍。因此，蛋白質(zhì)具有親水溶膠的因此，蛋白質(zhì)具有親水溶膠的性質(zhì)。性質(zhì)。 布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、不能布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜等。透過半透膜等。蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）表面形成水膜（水化層）；2）帶相同電荷。帶相同電荷。+（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固：（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固： 在某些物理或化學(xué)因素的作用下，蛋白在某些物理或化學(xué)因素

5、的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞空間結(jié)構(gòu)被破壞（不包括肽鍵的（不包括肽鍵的斷裂），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和斷裂），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，稱為生物學(xué)性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性。引起蛋白質(zhì)變性的因素有引起蛋白質(zhì)變性的因素有： 物理因素：物理因素：高溫、高壓、高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波紫外線、電離輻射、超聲波等；等； 化化學(xué)因素：學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、重金屬鹽等。有機(jī)溶劑、重金屬鹽等。 變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變： 物理性物理性質(zhì)質(zhì)：旋光性改變，溶解度下：旋光性改變，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光

6、吸降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；收度增加等； 化學(xué)性質(zhì)化學(xué)性質(zhì)：官能團(tuán)反應(yīng)性增加，易：官能團(tuán)反應(yīng)性增加，易被蛋白酶水解。被蛋白酶水解。 生物學(xué)性質(zhì)生物學(xué)性質(zhì)：原有生物學(xué)活性喪失，：原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變?？乖愿淖?。 蛋白質(zhì)變性的可逆性：蛋白質(zhì)變性的可逆性：a) 蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下是不能復(fù)性的；數(shù)情況下是不能復(fù)性的；b) 如如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或者蛋白構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或者蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，并經(jīng)質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，并經(jīng)特殊處理則特殊處理則可以復(fù)性。可以復(fù)性。核糖核酸酶的變性與

7、復(fù)性核糖核酸酶的變性與復(fù)性 蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為析出的現(xiàn)象稱為沉淀沉淀。 變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。 加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱為稱為凝固凝固。因此，凡凝固的蛋白質(zhì)。因此，凡凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性。一定發(fā)生變性。 二、蛋白質(zhì)的分離與純化二、蛋白質(zhì)的分離與純化（一）鹽析與有機(jī)溶劑沉淀：（一）鹽析與有機(jī)溶劑沉淀：1.1. 鹽析：鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，在蛋白質(zhì)溶液

8、中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽鹽析。析。 常用的中性鹽有：常用的中性鹽有：硫酸銨硫酸銨、氯、氯化鈉、硫酸鈉等?；c、硫酸鈉等。 鹽析時(shí)，溶液的鹽析時(shí)，溶液的pHpH在蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好。的等電點(diǎn)處效果最好。 鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，通常不鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。分段鹽析分段鹽析2. 2. 有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)： 凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用

9、于沉淀蛋白質(zhì)。用于沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀原理是：沉淀原理是： 脫水作用；脫水作用； 使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。溶解度降低。（二）電泳：（二）電泳： 帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳電泳。 蛋白質(zhì)分子在溶液中可帶凈的負(fù)電蛋白質(zhì)分子在溶液中可帶凈的負(fù)電荷或帶凈的正電荷，故可在電場(chǎng)中荷或帶凈的正電荷，故可在電場(chǎng)中發(fā)生移動(dòng)。不同的蛋白質(zhì)分子所帶發(fā)生移動(dòng)。不同的蛋白質(zhì)分子所帶電荷量電荷量不同，且不同，且分子大小分子大小也不同，也不同，故在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度也不同，據(jù)故在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度也不同，據(jù)此可互相分離。此可互相分離。 （三）層析：（三）層析： 層析層析是一種利用混合物中各組分理化是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分離分析的技術(shù)方法。行分離分析的技術(shù)方法。 主要的層析技術(shù)有離子交換層析，凝主要的層析技術(shù)有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等。膠層析，吸附層析及親和層析等。離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析凝膠層析凝膠層析凝膠過濾分離蛋白質(zhì)凝膠過濾分離蛋白質(zhì)親和層