蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例

1、第五章 蛋白質(zhì)工程 【知識目標(biāo)】 了解蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生背景及目前的發(fā)展?fàn)顩r。 理解蛋白質(zhì)工程的主要的研究過程及具體操作手段。 掌握蛋白質(zhì)工程的概念并明確其研究的目標(biāo)。 【技能目標(biāo)】 能夠運(yùn)用蛋白質(zhì)工程的基本原理解析在實(shí)際生產(chǎn)生活中蛋白質(zhì)工程應(yīng)用的實(shí)例。 掌握胰蛋白酶酶活力的測定方法。 第一節(jié) 蛋白質(zhì)工程概述 一、蛋白質(zhì)工程的概念 根據(jù)對蛋白質(zhì)己知結(jié)構(gòu)和功能的了解，借助計算機(jī)輔助設(shè)計，利用基因定點(diǎn)誘變等技術(shù)，特異性地對現(xiàn)有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行改造，借以改善蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，如提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酶的專一性等，或者利用化學(xué)和物理手段，對目標(biāo)基因按預(yù)期設(shè)計進(jìn)行進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)的技

2、術(shù)手段，并可以借此對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行更加深入的研究。第一節(jié) 蛋白質(zhì)工程概述 二、蛋白質(zhì)概述 （一）蛋白質(zhì)的組成 組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種其中除甘氨酸和脯氨酸外，均屬于 L-氨基酸第一節(jié) 蛋白質(zhì)工程概述 二、蛋白質(zhì)概述 （二）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu) 四級結(jié)構(gòu)第一節(jié) 蛋白質(zhì)工程概述 二、蛋白質(zhì)概述 （三）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 (1)相似的結(jié)構(gòu)具有相似的功能 (2)不同結(jié)構(gòu)具有不同的功能 2.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其功能活性也必然會隨之改變 第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程的研究方法 一、蛋白質(zhì)工程的研究策略 研究過

3、程就是通過嚴(yán)格的分子設(shè)計，把它定向地改造成一個具有預(yù)期的新的特性的蛋白質(zhì)。一種是對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造；另一種是完全重建一個新的蛋白質(zhì)。在具體操作中，前者是對天然蛋白質(zhì)中的少數(shù)幾個氨基酸殘基進(jìn)行的替換(小改)、分子剪裁(中改)或者局部重建(大改)；后者是從頭設(shè)計個全新的蛋白質(zhì)。我們目前的蛋白質(zhì)工程研究中主要進(jìn)行的是“小改”和“中改”。第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程的研究方法 二、改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) （一）小改少數(shù)幾個氨基酸殘基的替換 定點(diǎn)突變是目前蛋白質(zhì)工程研究的主要技術(shù)手段。 （二）中改分子剪裁 分子剪裁是指在對天然蛋白質(zhì)的改造中替換一個肽段或一個結(jié)構(gòu)域。第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程的研究方法 三、蛋白質(zhì)全新設(shè)計

4、 對蛋白質(zhì)的全新設(shè)計所應(yīng)用的技術(shù)手段是我們前面所提到的“大改”或“從頭設(shè)計“工作 是在人們認(rèn)識蛋白質(zhì)、掌握其結(jié)構(gòu)規(guī)律并了解其結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。同時也是人們更加深入全面認(rèn)識蛋白質(zhì)的一個過程，它的目的是人工創(chuàng)造出自然界中不存在的蛋白質(zhì)分子，使之具有人們所需要的特殊結(jié)構(gòu)和功能，為人類所利用。 目前該技術(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)初級階段。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 一、胰蛋白酶 胰蛋白酶（EC3.4.21.4）是絲氨酸蛋白酶類，它是一條單鏈肽，由223個氨基酸殘基組成，N末端為異亮氨酸。主要作用于精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。第三節(jié)

5、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 一、胰蛋白酶 胰蛋白酶極易自溶，自溶產(chǎn)物經(jīng)層析分離后，會得到4個具有胰蛋白酶活性的片段。通過對N末端殘基的分析，表明這些活性產(chǎn)物是由于Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160處發(fā)生了斷裂而出現(xiàn)的。人們運(yùn)用了蛋白質(zhì)工程手段，對Arg117位自溶點(diǎn)進(jìn)行了缺失突變，最終得到了穩(wěn)定性明顯提高的突變株。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 二、金屬硫蛋白 金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是由微生物和植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白，是一類富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸殘基和金屬含量極高的蛋白質(zhì)，可以通過半胱氨酸的巰基結(jié)合大量的金屬素，對多種

6、重金屬有高度的親和性。一般由兩個大小相近，結(jié)構(gòu)與功能類似的結(jié)構(gòu)域組成，即-結(jié)構(gòu)域和-結(jié)構(gòu)域。人們?yōu)閷⒑?結(jié)構(gòu)域的基因轉(zhuǎn)移到煙草中，成功的獲得了對鎘，銅，鉛等重金屬具有較高抗性的工程株。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 三、人白細(xì)胞介素-2 IL-2是第個被發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素。天然人白細(xì)胞介素-2是一個由133個氨基酸殘基組成的多肽，133個氨基酸中共有3個半胱氨酸，其中有一個半胱氨酸（Cys125）以游離方式存在，而另兩個半胱氨酸（Cys58和Cys105）縮合成活性所必需的二硫鍵。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 三、人白細(xì)胞介素-2 人們用蛋白質(zhì)工程中的定位誘變技術(shù)將Cys125的密碼TGT轉(zhuǎn)換成

7、TCT或GCA，使Cys125轉(zhuǎn)換成絲氨酸或丙氨酸，避免了錯誤配對的產(chǎn)生。結(jié)果不但使IL-2的生物活性不受影響，而且其熱穩(wěn)定性等方面也得到了較明顯的改善。工程IL-2目前已被美國FDA批準(zhǔn)上市，用于治療腎細(xì)胞瘤。我國衛(wèi)生部也已經(jīng)批準(zhǔn)了在國內(nèi)試生產(chǎn)基因工程白細(xì)胞介素-2。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 四、組織纖維蛋白溶酶原激活因子 tPA能夠切割纖溶酶原形成纖溶酶，從而激活纖溶作用(fibrino1ysis)，使血栓溶解。作為一種高效特異性溶血栓藥物。優(yōu)點(diǎn) :(1)血栓選擇性高但幾乎不激活循環(huán)血液中的纖溶系統(tǒng)，可直接靜脈注射；(2)對中毒性休克引起的彌散性血管內(nèi)凝血療效顯著等。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程

8、的應(yīng)用實(shí)例 四、組織纖維蛋白溶酶原激活因子 利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)，改變tPA分子中的某些糖基化氨基酸而減少或避免了糖基化，有效地減緩了它在血漿中被清除的速率，達(dá)到了延長其半壽期的目的，臨床應(yīng)用價值得到有效提高第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 五、枯草桿菌蛋白酶 枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)是由枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)合成的一種絲氨酸蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶根據(jù)來源的不同可分為Carlsberg，E，BL，YaB等多種。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 五、枯草桿菌蛋白酶 枯草桿菌蛋白酶可以催化蛋白質(zhì)，把蛋白質(zhì)水解成氨基酸。具有重要的應(yīng)用價值，被廣泛應(yīng)用在洗滌劑、制革及

9、絲綢工業(yè)中，是一種重要的工業(yè)用酶。三維結(jié)構(gòu)及編碼基因目前已經(jīng)基本搞清楚，而且配有合適的克隆、表達(dá)系統(tǒng)以及準(zhǔn)確的定量分析催化活性的方法，因此缺點(diǎn)目前已經(jīng)可以通過蛋白質(zhì)工程得到改進(jìn)第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 五、枯草桿菌蛋白酶 對枯草桿菌蛋白酶所做的定點(diǎn)誘變已有400多個，在理論和應(yīng)用方面均取得了相當(dāng)大的進(jìn)展和成功?？莶輻U菌蛋白酶早在幾十年前就被開發(fā)成為商用的紡織品洗滌劑的添加酶，目前仍然是最基本、最重要，也是使用最廣泛、最成熟的洗滌用酶。應(yīng)用定點(diǎn)改造后的枯草桿菌蛋白酶制成的洗滌劑，便可以實(shí)現(xiàn)與漂白劑共同使用的目的了。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 五、枯草桿菌蛋白酶 另一方面枯草桿菌蛋白酶在作為

10、蛋白質(zhì)工程的研究對象過程中，不僅僅使它自身的諸多性能得到了改善；更為重要的是在研究它的過程中，蛋白質(zhì)工程的研究理論同時也得到了大大的豐富，這為蛋白質(zhì)工程技術(shù)應(yīng)用于其他酶的研究，尤其是對其他工業(yè)酶的性能改造提供了非常珍貴的范例和理論指導(dǎo)。胰蛋白酶酶活力的測定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握胰蛋白酶的基本性質(zhì)； 2.學(xué)會純化、結(jié)晶胰蛋白酶的基本方法； 3.能夠獨(dú)立完成胰蛋白酶的活性及比活性的測定。 胰蛋白酶酶活力的測定 二、實(shí)驗(yàn)原理 胰蛋白酶可以催化蛋白質(zhì)的水解，化學(xué)鍵的催化水解活性的敏感性依次為：酯鍵 酰胺鍵 肽鍵?？梢岳煤羞@些鍵中的任一鍵形的化合物作為底物來測定胰蛋白酶的專一催化活性。 本實(shí)驗(yàn)以B

11、AEE為底物，用紫外吸收法測定胰蛋白酶活力。胰蛋白酶酶活力的測定 三、試劑和器材 1.材料 新鮮或速凍的豬胰臟 2.儀器 剪刀、鑷子；絞肉機(jī)；研缽；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽濾瓶； 顯微鏡；紗布；恒溫水浴鍋；紫外分光光度計；計時器；pH試紙。胰蛋白酶酶活力的測定 三、試劑和器材 3.試劑 pH2.5乙酸酸化水；2.5mol/L H2SO4；5 mol/L NaOH； 2 mol/L NaOH；2mol/L HCl；0.001 mol/L HCl；硫酸銨；氯化鈣。 0.8 mol/L pH9.0硼酸緩沖液：取20mL 0.8 mol/L硼酸溶液，加80mL 0.2 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，

12、用pH計檢查校正。 0.4 mol/L pH9.0硼酸緩沖液（用0.8 mol/L稀釋1倍即可）； 0.2 mol/L pH8.0硼酸緩沖液：取70mL 0.2 mol/L硼酸溶液，加30mL 0.05 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計校正。 0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl 緩沖液：取50mL 0.1 mol/Ltris（三羥甲基氨基甲烷），加29.2 mL 0.1mol/L HCl ，再加水定容至100mL。 BAEE底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl 緩沖液中加0.34mgBAEE和2.22mg的氯化鈣。胰蛋白酶酶活力的測定

13、四、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）豬胰蛋白酶制備 1.豬胰蛋白酶原的提取 2.胰蛋白酶原激活 3.胰蛋白酶的分離 4.胰蛋白酶的結(jié)晶 5.胰蛋白酶的重結(jié)晶胰蛋白酶酶活力的測定 四、實(shí)驗(yàn)步驟 （二）胰蛋白酶活性的測定 以苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）為底物，用紫外吸收法進(jìn)行測定稀釋倍數(shù)酶液加入體積）單位位（胰蛋白酶溶液的活力單0.001/minA/mLBAEE253nm酶液加入體積）酶液濃度（酶液活力）單位胰蛋白酶比活力（mLmg /mgBAEE胰蛋白酶酶活力的測定 五、注意事項(xiàng) 1.胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或速凍的。 2.在室溫1420條件下812h可激活完全，比活性達(dá)到“30004000BAEE單位

14、/mg蛋白”時即可停止激活。 3. 進(jìn)行結(jié)晶時應(yīng)十分細(xì)心地按規(guī)定條件操作。 4. 必須嚴(yán)格控制PH。 5.第一次結(jié)晶時，35d后仍然無結(jié)晶，應(yīng)檢查pH，必要時調(diào)整pH，促使結(jié)晶形成。胰蛋白酶酶活力的測定 六、思考題 1提取制備豬胰蛋白酶的過程中，應(yīng)特別注意哪些因素？ 2PH值在制備中起到什么作用？ 3影響晶體形成的因素有哪些？ 4在測定酶的比活力過程中應(yīng)注意哪些因素？第一節(jié) 蛋白質(zhì)工程概述 一、蛋白質(zhì)工程的概念 根據(jù)對蛋白質(zhì)己知結(jié)構(gòu)和功能的了解，借助計算機(jī)輔助設(shè)計，利用基因定點(diǎn)誘變等技術(shù)，特異性地對現(xiàn)有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行改造，借以改善蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，如提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酶的專一性等

15、，或者利用化學(xué)和物理手段，對目標(biāo)基因按預(yù)期設(shè)計進(jìn)行進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)的技術(shù)手段，并可以借此對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行更加深入的研究。第一節(jié) 蛋白質(zhì)工程概述 二、蛋白質(zhì)概述 （三）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 (1)相似的結(jié)構(gòu)具有相似的功能 (2)不同結(jié)構(gòu)具有不同的功能 2.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其功能活性也必然會隨之改變 第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程的研究方法 一、蛋白質(zhì)工程的研究策略 研究過程就是通過嚴(yán)格的分子設(shè)計，把它定向地改造成一個具有預(yù)期的新的特性的蛋白質(zhì)。一種是對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造；另一種是完全重建一個新的蛋白質(zhì)。在具體操作中，前者是對天然蛋白質(zhì)中的少數(shù)幾個氨基酸殘基進(jìn)行的替換(小改)、分子剪裁(中改)或者局部重建(大改)；后者是從頭設(shè)計個全新的蛋白質(zhì)。我們目前的蛋白質(zhì)工程研究中主要進(jìn)行的是“小改”和“中改”。第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 三、人白細(xì)胞介素-2 人們用蛋白質(zhì)工程中的定位誘變技術(shù)將Cys125的密碼TGT轉(zhuǎn)換成TCT或GCA，使Cys125轉(zhuǎn)換成絲氨酸或丙氨酸，避免了錯誤配對的產(chǎn)生。結(jié)果不但使IL-2的生物活性不受影響，而且其熱穩(wěn)定