空腸彎曲菌致周圍性自身免疫性周圍神經(jīng)病的實驗研究

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減空腸彎曲菌致周圍性自身免疫性周圍神經(jīng)病的實驗研究(作者：單位：郵編：)作者：向淑利袁平李經(jīng)倫胡先武【摘要】目的建立發(fā)病率高、具有典型臨床表現(xiàn)的空腸彎曲菌(CJ)相關(guān)的軸索性自身免疫性周圍神經(jīng)病的動物模型。方法將Wistar大鼠隨機(jī)分成三組：I組以CJ脂多糖(CJLPS、II組以CJLPS和鎖眼形喊血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)、皿組以KLH免疫，進(jìn)行臨床表現(xiàn)觀察和坐骨神經(jīng)病理學(xué)檢查。結(jié)果I組和皿組中沒有動物臨床發(fā)病。II組中60%(6/10)的動物出現(xiàn)了肌肉無力表現(xiàn)。病理學(xué)檢查I組神經(jīng)原纖維異常率14.3%(57/400)

2、,II組神經(jīng)原纖維率達(dá)17.3%(69/400),均明顯高于皿組(X2=44.815,P0.01;X2=58.394,P0.01)0I組與II組的病變主要表現(xiàn)為軸索變性，二者病變的發(fā)生率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論以CJLPS+KLHfe疫大鼠誘發(fā)出了發(fā)病率較高、具有典型臨床表現(xiàn)的CJ相關(guān)的軸索性自身免疫性周圍神經(jīng)病的動物模型?！娟P(guān)鍵詞】彎曲菌空腸周圍神經(jīng)病動物模型AbstractObjectiveToconstructananimalmodelbyDOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減immunizationwithCampylobacterjejunilipopolysaccharide(CJL

3、PS)andkeyholelimpethemocyanin(KLH).Methods30Wistarratswererandomlydividedintothreegroups.GroupI,groupII,andgroup皿wereimmunizedwithCJLPS,CJLPS+KLHandKLHrespectively.Clinicalpresentationsandpathologicalchangeswereobserved.ResultsWeaknessappearedin6/10ofgroupI.NoneofgroupIandgroup皿showedweakness.Teased

4、fibersstudyrevealedthattheincideneeofpathologicalfibersofsciaticnervesingroup1(14.3%)andingroupI(17.3%)washigherthangroup皿(X2=44.815,P0.01andX2=58.394,P0.01respectively);therewasnodiffereneebetweengroupIandgroupHR.TransversesectionsofsciaticnervesshowedaxonaldegenerationingroupIandgroup皿.Conclusions

5、AnanimalmodelofaxonalperipheralneuropathyassociatedwithCampylobacterjejunicouldbeconstructedbyimmunizationwithCJLPSandKLH.KeywordsCampylobacterjejunianimalmodelperipheralneuropathy自身免疫性周圍神經(jīng)病即格林一巴利綜合征(Guillain-Barresyndrome,GBS)分布全球，自脊髓灰質(zhì)炎在世界大部分地區(qū)消滅以來，已成為最常見的周圍性神經(jīng)病。我國和日本等國家的GBS主要為DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減軸索

6、型即軸索性自身免疫性周圍神經(jīng)病(axonalGBS)。GBS在我國農(nóng)村多見，夏秋季節(jié)為發(fā)病高峰?？傮w來說CJ致GBS的發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚，分子模擬是一個重要的學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為CJLPS(lipopolysaccharide，脂多糖)與人神經(jīng)節(jié)昔脂尤其是GM1GD1a和GQ1b之間存在分子模擬現(xiàn)象，CJLPS與人周圍神經(jīng)組織中神經(jīng)節(jié)昔脂擁有共同的表位，機(jī)體產(chǎn)生的抗_LPS抗體與神經(jīng)節(jié)昔脂結(jié)合發(fā)生交叉反應(yīng)，激活補(bǔ)體等，產(chǎn)生病變1。然而以CJLPS免疫動物雖然誘發(fā)出了軸索型病理改變的GBS動物模型，但臨床發(fā)病率低2,3o本研究以CJLPS和鎖眼形喊血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocya

7、nin,KLH)免疫大鼠，誘發(fā)出發(fā)病率高、具有典型臨床表現(xiàn)的動物模型，為研究該疾病提供重要工具。1 材料與方法1.1 材料菌株CJ0:19,系從1例GBS患者分離獲得，購自北京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床病毒室。Wistar大鼠。KLH購自美國Sigm公司以PBS溶解。將CJ血清型0:19凍存菌種復(fù)蘇，劃線接種于Camp-BA培養(yǎng)基上，42c微環(huán)境(5%0210%C0285%N2中培養(yǎng)48小時后，收集菌體或者繼續(xù)傳代培養(yǎng)。1.2 CJO:19LPS提取4采用熱酚-水法，經(jīng)RNA酶彳DNA酶I和蛋白酶K處理，低溫超速離心純化，經(jīng)SDS-PAG電泳和銀氨染色。1.3 CJLPS免疫大鼠60只6-8周齡

8、的雄性健康大鼠，隨機(jī)被分成三組：1組、H組和皿組，每組各20只。I組，純化LPS5001g作為免疫原，按每次500Jg/只LPS（以PBS稀釋）注射于背部皮下。H組貝RI以500JgLPS+200AgKLH,皿組，200JgKLH為免疫原。每組動物免疫共5次，相互間隔7d,每次共40011,各組免疫初次加等量完全弗氏佐劑，以后加不完全弗氏佐劑充分乳化。初次免疫后第8w或者出現(xiàn)臨床癥狀后3d,分別以多聚甲醛和戊二醛體內(nèi)灌流固定，取坐骨神經(jīng)，進(jìn)行病理學(xué)檢查。1.4 大便培養(yǎng)CJ按Pei等5的方法，連續(xù)監(jiān)測大便，免疫前、表現(xiàn)肌無力后或者初次免疫后第8w取4-5粒新鮮大便用無菌PBS制成5%的懸液，0

9、.05ml大便勻漿涂布到CJ選擇性的Camp-BAP培養(yǎng)平板上，42c微氧環(huán)境中孵育5d。對生長的菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)和氧化酶反應(yīng)鑒定。1.5 CJLPS全身性免疫后大鼠坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)檢查初次免疫后第8w或者出現(xiàn)臨床癥狀后3d,分別以多聚甲醛和戊二醛體內(nèi)灌流固定，取坐骨神經(jīng)，進(jìn)行病理學(xué)檢查，包括：（1）原纖維分離；（2）半薄切片光鏡觀察：高倍鏡下觀察有無原纖維喪失'軸索變性'髓鞘脫失'間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤。凡有上述一項病理改變且分布范圍超過神經(jīng)束橫切面積1/2者，視為顯著異常；不及1/2或散在性纖維病變者為輕度異常。1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，對計數(shù)

10、資料進(jìn)行X2檢驗。2.1 CJLPS的鑒定電泳后的LPS經(jīng)銀氨染色，出現(xiàn)理想的LPS條'rfj'o2.2 臨床觀察I組和皿組中沒有動物表現(xiàn)出肢體無力或者共濟(jì)失調(diào)。II組10中有6只在初次免疫后第35-53天之間出現(xiàn)了無力表現(xiàn)。所有實驗動物沒有出現(xiàn)意外死亡。2.3 大便培養(yǎng)CJ免疫前、表現(xiàn)肌無力后或者初次免疫后8w大便培養(yǎng)CJ均為陰性。表明在實驗前及實驗中動物均沒有發(fā)生CJ感染。2.4 CJLPS全身性免疫后坐骨神經(jīng)原纖維的總病變率分別檢測各組400根神經(jīng)原纖維(10只大鼠)，I組(LPS免疫組)神經(jīng)原纖維異常率達(dá)14.3%(57/400),其中65.0%為軸索變性。LPS免疫組

11、異常原纖維發(fā)生率明顯高于對照組(1.5%,6/400,X2=44.815,P0.01),說明LPS存在明顯致免疫性周圍神經(jīng)損傷危險。H組原纖維異常率達(dá)17.3%(69/400),其中63.0%為軸索變性。H組原纖維異常率明顯高于皿組(X2=58.394,P0.01),但H組原纖維異常率和I組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=1.357,P0.05)o2.5 CJLPS全身免疫后坐骨神經(jīng)半薄切片光鏡觀察I組有60%(12/20)的切片異常，其中67%(8/12)為輕度異常，33%(4/12)為顯著異常，主要表現(xiàn)為不同程度的軸索變性及原纖維丟失。"組75%(15/20)的切片異常，其中47%(

12、7/15)為輕度異常，53%(8/15)為顯著異。而皿組僅出現(xiàn)10%(2/20)切片輕度異常，表現(xiàn)為軸索變性及神經(jīng)原纖維丟失。3討論自身免疫性周圍神經(jīng)病即格林一巴利綜合征(Guillain-Barresyndrome,GBS已成為最常見的周圍性神經(jīng)病。根據(jù)神經(jīng)電生理學(xué)和病理學(xué)將自身免疫性周圍神經(jīng)病分為兩種類型：一為脫髓鞘型即急性炎癥性脫髓鞘性周圍神經(jīng)病(Acuteinflammatorydemyelinatingpolyneuropathy,AIDP)二為軸索型即軸索性自身免疫性周圍神經(jīng)病(axonalGBS)。目前GBS確切病因不明，流行病學(xué)資料顯示，發(fā)病可能與空腸彎曲菌(C.jejuni,

13、CJ)、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、肺炎支原體等感染相關(guān)。其中，CJ是最重要的前驅(qū)感染原之一，國外高達(dá)50%國內(nèi)高達(dá)76%患者病前有CJ感染的證據(jù)。CJ致GBS比其他病原體相關(guān)的GBS更為嚴(yán)重，1/2的患者功能恢復(fù)不良，因而更受到學(xué)者們的廣泛重視和研究?？傮w來說CJ致GBS的發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚。但國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者都傾向于分子模擬學(xué)說。良好的疾病動物模型是研究相應(yīng)疾病發(fā)生機(jī)理和治療的重要工具。雖然已成功地用髓鞘蛋白或其成分誘發(fā)出了動物模型即EAN(experimentalallergicneuritis,實驗性過敏性神經(jīng)炎)。近年，又有學(xué)者用神經(jīng)節(jié)昔脂GM1免疫兔誘發(fā)出了軸索型自身免疫性周圍神經(jīng)病的

14、動物模型。然而，國內(nèi)外尚無用CJ菌體成分誘發(fā)出發(fā)病率高、具有典型臨床表現(xiàn)的CJ致GBS理想的動物模型的報道。CJ李春巖等用軸索型自身免疫性周圍神經(jīng)病患者分離出來的LPS加上弗氏佐劑作為免疫佐劑雖然也誘發(fā)出CJ致自身免疫性周圍神經(jīng)病，但發(fā)病率低，僅約百分之十幾(1/8,3/26)2,3°KLHkeyholelimpethemocyanin,鎖眼形喊血藍(lán)蛋白)是從一種福洋最體動物血淋巴液提取高分子量的蛋白質(zhì)抗原，是一種體內(nèi)強(qiáng)有力的非特異性的免疫增強(qiáng)劑，既能誘導(dǎo)體液免疫又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。由于它含有碳水化合物表位Gal(beta1-3)GalNAc,因此它常作為神經(jīng)節(jié)昔脂類的佐劑使用,例如G

15、M2-KL治療膀胱癌。國外已有KLH應(yīng)用在神經(jīng)節(jié)昔脂或者LPS的免疫模型，尤其是CJLPS與KLH和弗氏佐劑聯(lián)合免疫新西蘭大白兔成功建立GBS動物模型6,但還沒有用此來免疫大鼠的報道。本研究提取自GBS患者分離的CJLPS,與KLH和弗氏佐劑一起免疫大鼠，誘發(fā)出發(fā)生率較高的臨床癥狀，坐骨神經(jīng)的組織病理學(xué)檢查顯示了軸索變性的重要病理改變，為探討軸索型GBS的發(fā)病機(jī)理以及進(jìn)一步的特異性免疫治療提供重要工具。參考文獻(xiàn)1 YukiNHumangangliosidesandbacteriallipo-oligosaccharidesinthedevelopmentofautoimmuneneuropat

16、hiesJ.MethodsMolBiol.2010;600:51-65.2 李春巖，田文強(qiáng)，劉瑞春等.PEN019空腸彎曲菌的脂多糖致軸索型格林-巴利綜合征動物模型研究J.中華物理醫(yī)學(xué)雜志.1997；3(19)33-35.3王強(qiáng)，王虹蛟，林世和等.實驗性軸索型格林-巴利綜合征動物模型的建立J.中華醫(yī)學(xué)雜志.2000；12(80):947-949.4 WestphalO,JannK.Bacteriallipopolysaccharides:extractionwithphenolwaterandfurtherapplicationsofthetechniqueJ.MethodsCarbohydrChem1965;5:883-880.5 PeiZ,BurucoaC,GrignonB,etal.MutationinthepeblAlocusofCampylobacterjejunireducesinteractionswithepithelialcel