補體檢測及應(yīng)用(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第十九章補體檢測及應(yīng)用補體是一組存在于人和脊椎動物血清、組織液或某些細(xì)胞膜上的具有酶樣活性、不耐熱的糖蛋白。補體不是單一成分，其在功能效應(yīng)上是以連續(xù)反應(yīng)的程序進行的，故又稱補體系統(tǒng)。補體系統(tǒng)廣泛參與機體的抗感染防御反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是體內(nèi)具有重要生物學(xué)作用的效應(yīng)放大系統(tǒng)。補體的存在與抗原性異物的刺激無關(guān)，在正常人血清中，其含量相對穩(wěn)定，但在某些疾病發(fā)生時，補體的含量及其活性可發(fā)生改變。因此，補體含量與活性的檢測，對機體免疫狀態(tài)的評價和疾病的診斷具有重要意義。 第一節(jié)概述一、補體成分的含量與理化特性（一）補體成分的含量：補體大多為糖蛋白，屬于

2、球蛋白，C1q、C8等為球蛋白，C1s、C9為球蛋白。C3含量最高。補體活化后的裂解片段以該成分的符號后加小寫英文字母表示，通常a為小片段，b為大片段，但C2a為大片段，C2b為小片段。補體各成分活化后不參與溶細(xì)胞過程的裂解片段，同樣具有其他對機體利弊兼有的生物學(xué)活性，故裂解片段的測定，一方面可反映機體補體的活性狀態(tài)，另一方面也是某些疾病診斷不可或缺的指標(biāo)。補體系由非均一的細(xì)胞群體產(chǎn)生，在排除補體消耗太多的前提下，補體缺陷也可反映這些細(xì)胞的狀態(tài)。體內(nèi)合成補體成分的部位和細(xì)胞有多種，以肝臟、脾臟、小腸等組織和巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血小板等細(xì)胞為主。（二）補體的理化特性：補體的性質(zhì)不穩(wěn)定，易受各種理

3、化因素的影響，加熱、紫外線照射、機械振蕩、酸堿和酒精等因素均可破壞補體。在-10活性保持34天，冷凍干燥可較長時間保持其活性，加熱5630分鐘滅活（滅能），故補體活性檢測應(yīng)盡快進行。標(biāo)本保存應(yīng)置于-20以下。二、補體的活化途徑補體蛋白通常以活化蛋白前體存在于體液中，在不同激活物的作用下，補體各成分可循不同的途徑依次被活化，形成一系列級聯(lián)反應(yīng)，表現(xiàn)出生物活性，最終導(dǎo)致溶細(xì)胞效應(yīng)。1.經(jīng)典途徑：以抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合C1q啟動激活，是抗體介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)方式。2.MBL途徑：是甘露聚糖結(jié)合凝集素（MBL）結(jié)合至細(xì)菌啟動的途徑。其誘導(dǎo)物或激活劑是機體的炎癥反應(yīng)急性期時相性蛋白產(chǎn)生的MBL

4、和C反應(yīng)蛋白等，后者與病原體結(jié)合而啟動繞過C1的MBL途徑。3.旁路途徑：是通過微生物表面等膜性物質(zhì)，從C3開始，由B因子、D因子參與激活過程，也稱第二途徑、旁路途徑。這種激活方式不依賴于特異性抗體的形成，在感染早期可為機體提供有效的防御機制。在機體抗感染過程中，首先活化和發(fā)揮作用的補體途徑，是不依賴抗體的旁路途徑和MBL途徑。而在特異性抗體產(chǎn)生時，經(jīng)典途徑方可發(fā)揮作用。 第二節(jié)補體總活性測定血清補體總活性的測定，是對激活后補體最終效應(yīng)的檢測方法，可借此反映補體的整體功能。以紅細(xì)胞的溶解為指示，以50%溶血為判斷終點，故稱CH50。包括：基于經(jīng)典途徑的CP-CH50和應(yīng)用于C3旁路檢測的AP-

5、CH50。CP-CH50是臨床常規(guī)進行的補體總活性檢測項目。通常述及的CH50系指CP-CH50。一、CH50測定法的原理補體最主要的活性是溶細(xì)胞作用。特異性抗體與紅細(xì)胞結(jié)合后可激活補體，導(dǎo)致紅細(xì)胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分滲入，引起紅細(xì)胞腫脹導(dǎo)致溶血。補體溶血程度與補體的活性相關(guān)，但非直線關(guān)系。溶血反應(yīng)對補體的劑量依賴呈一特殊的S形曲線。以溶血百分率為縱坐標(biāo)，相應(yīng)血清量為橫坐標(biāo)。S形曲線在30%70%之間幾乎呈直線，即曲線此階段對補體量的變化非常敏感。因此，實驗常以50%溶血作為終點指標(biāo)，它比100%溶血更為敏感，這一方法稱為補體50%溶血實驗，即CH50。二、CH50測定方法1.紅細(xì)胞濃

6、度的調(diào)整2.溶血素滴定3.稀釋緩沖液：磷酸緩沖液或巴比妥緩沖液等均可用于溶血試驗。4.50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管：做CH50試驗時，應(yīng)同時配制50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管。5.50%溶血總補體值的計算三、方法評價與臨床意義CH50測定補體活性，方法簡便、快速，雖敏感性較低，但可以滿足對血清補體含量測定的要求。影響補體活性測定結(jié)果的因素較多，諸如反應(yīng)所用的緩沖液、SRBC的數(shù)量和狀態(tài)、反應(yīng)溫度、pH、離子強度以及反應(yīng)容器的潔凈程度等。該法主要檢測的是補體經(jīng)典途徑的溶血活性，所得結(jié)果反映補體C1C9等9種成分的綜合水平。如果CH50測定值過低或者完全無活性，應(yīng)考慮補體缺陷；可再通過C4、C2、C3和C5等單個補體成分的

7、檢測，區(qū)別是否因某一成分缺乏所致，以便做出確切的實驗室診斷。嚴(yán)重肝病或營養(yǎng)不良時，由于蛋白合成障礙，引起血清補體水平的下降。而系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強直性脊柱炎等自身免疫病患者，疾病活動期補體活化過度，血清補體因消耗增加而水平下降；病情穩(wěn)定后補體水平又反應(yīng)性增高。因此，補體檢測?？捎糜谧陨砻庖卟〉脑\斷，也可作為某些疾病活動期的參考指標(biāo)。在細(xì)菌感染，特別是革蘭陰性細(xì)菌感染時，常因補體旁路途徑的活化而引起血清補體水平的過度降低；而心肌梗死、甲狀腺炎、大葉性肺炎、糖尿病、妊娠等情況下，血清補體水平常見升高。 第三節(jié)單個補體成分的測定C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等，常被作為單個補

8、體成分的檢測指標(biāo)。常用免疫溶血法檢測單個補體成分的活性；基于抗原抗體反應(yīng)的血清學(xué)法（免疫化學(xué)法）測定其含量。目前應(yīng)用自動化免疫散射比濁法可準(zhǔn)確測定體液中C3、C4等多個單一的補體成分。一、免疫溶血法該方法中抗原為SRBC，抗體為兔或馬抗SRBC的抗體（IgG、IgM型），即溶血素。試驗中有兩組補體參與，一組缺少待測成分的試劑（R試劑）。加入致敏SRBC（檢測經(jīng)典途徑補體成分用）或兔紅細(xì)胞RRBC（檢測替代途徑補體成分用）后，不發(fā)生溶血。另一組為待測血清中的補體，當(dāng)加入待測血清，補體成分齊全，產(chǎn)生溶血。溶血程度與待測補體成分活性有關(guān)，仍以50%溶血為終點。采用免疫溶血法檢測待測標(biāo)本中某一單個補體

9、成分是否缺乏，可以幫助診斷補體某個成分缺失或其含量正常但無溶血活性的先天性補體缺陷。無需特異儀器與設(shè)備，快速，但敏感性較低，影響因素多。該法不是檢測某補體成分的具體含量，而是檢測其活性，在某些需了解該成分活性情況下，本試驗適用。二、免疫化學(xué)法分為單向免疫擴散、火箭免疫電泳、透射比濁法和散射比濁法。后兩種方法可通過儀器對補體的C3、C4、B因子等單個成分進行自動化測定。待測血清標(biāo)本中的C3、C4成分，經(jīng)適當(dāng)稀釋后與相應(yīng)抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，反應(yīng)介質(zhì)中的PEG可使該復(fù)合物沉淀，儀器對復(fù)合物產(chǎn)生的光散射或透射信號進行自動檢測，并換算成所測成分的濃度單位。該法是借助補體的抗原性和與相應(yīng)抗體反應(yīng)的前帶原理

10、建立的補體單個成分定量檢測法。利用前帶原理必須以過量的抗補體抗體保證準(zhǔn)確測定的質(zhì)量。因其簡單、特異、重復(fù)性好、自動化程度高而頗受使用者歡迎。自動免疫比濁法可反映所測補體成分的絕對量，并能進行標(biāo)準(zhǔn)化流程管理與質(zhì)量控制，是目前國內(nèi)外臨床免疫檢測中的主要檢測方法。 第四節(jié)補體結(jié)合試驗（CFT）將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。該方法并非用于補體的檢測，而是利用補體的溶細(xì)胞作用進行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測定。一、試驗原理包括反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）與待測抗體（或抗原）；補體系統(tǒng)；指示系統(tǒng)：SRBC與相應(yīng)溶血素預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞。反應(yīng)分兩步進行。首先是反應(yīng)

11、系統(tǒng)與補體的作用；第二步是指示系統(tǒng)利用剩余補體的反應(yīng)。如反應(yīng)系統(tǒng)中有抗體或抗原，則形成免疫復(fù)合物而固定和消耗補體，使后加入的SRBC-抗SRBS指示系統(tǒng)無多余補體可利用，則無溶血反應(yīng)發(fā)生，反之亦然。不溶血為補體結(jié)合試驗陽性，而溶血為試驗陰性。試驗中將反應(yīng)系統(tǒng)的待測抗原（或抗體）作系列倍比稀釋可作半定量測定。試驗中以50%不溶血作為判斷終點。二、試驗方法（一）試劑的準(zhǔn)備1.抗原或抗體2.補體：采用豚鼠血清為補體。3.待測標(biāo)本：及時分離血清用于檢測或-20保存?zhèn)溆?。試驗前，?yīng)先將血清56加熱30分鐘（或603分鐘）以滅活補體。血清標(biāo)本遇有抗補體現(xiàn)象時，可作下列處理：加熱滅活時提高l2；-20凍融后

12、離心去沉淀；以3mmol/L鹽酸處理；加入少量補體后再行滅活；以白陶土處理；通入CO2；以小白鼠肝粉處理；用含l0%新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋血清。（二）正式試驗：小量法較為常用。三、方法評價補體結(jié)合試驗是一經(jīng)典的免疫技術(shù)，具有靈敏度高、可檢測的抗原或抗體范圍廣泛等優(yōu)點。該方法無需特殊設(shè)備，結(jié)果容易觀察，試驗條件要求不高，一般醫(yī)院均具備開展的條件。 第五節(jié)補體受體的測定補體受體存在于多種細(xì)胞，是清除免疫復(fù)合物、凈化機體內(nèi)環(huán)境的重要膜性成分。在若干補體成分中，C3是各活化途徑的交匯點，且含量最多，故C3受體為測定的重點。 第六節(jié)補體測定的應(yīng)用補體的單個成分及總補體活性的測定，對于評價機體免疫功能、

13、診斷與治療疾病、流行病學(xué)調(diào)查等均有重要的意義。同時，可根據(jù)補體的溶細(xì)胞活性和級聯(lián)反應(yīng)的性質(zhì)，用于抗原或抗體的檢測、免疫復(fù)合物的測定等。1.補體相關(guān)試驗 用于診斷梅毒螺旋體感染的華氏反應(yīng)（已淘汰）。2.補體含量和活性檢測 反映總補體活性的CH50試驗；用于檢測補體單個成分及其裂解產(chǎn)物和補體受體的溶血試驗、免疫化學(xué)試驗和免疫熒光技術(shù)等。3.與補體含量和活性相關(guān)的疾病 主要包括：（1）免疫相關(guān)性疾?。?）與補體有關(guān)的遺傳性疾病（3）高補體血癥：偶見于感染恢復(fù)期和某些惡性腫瘤患者，如C2、C3、C4的升高。急性病毒性肝炎、心肌梗死、糖尿病甚至正常妊娠時，也可觀察到補體值的增高。（4）補體含量顯著降低的

14、疾?。豪^發(fā)性補體降低常見于下列情況：消耗增多，如SLE、冷球蛋白血癥、自身免疫性溶血性貧血、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥反應(yīng)等，此時因免疫復(fù)合物形成，消耗補體；補體的大量丟失，主要見于大面積燒傷患者、失血及腎臟病患者；補體合成不足，常見于肝臟疾病患者或營養(yǎng)不良的患者。此外，細(xì)菌（特別是G-）感染時，常因補體替代途徑的活化使補體水平暫時降低。補體總活性測定采用A.凝集法B.沉淀法C.溶血法D.電泳法E.標(biāo)記法  正確答案C答案解析補體總活性測定常采用的是CH50試驗。補體結(jié)合試驗的指示系統(tǒng)是A.特異性抗體和補體B.特異性抗原和補體C.紅細(xì)胞和溶血素D.加熱滅活的患者血清E.補體和溶血素  正確答案C答案解析補體結(jié)合試驗試驗原理：包括反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）與待測抗體（或抗原）；補體系統(tǒng)；指示系統(tǒng)：SRBC與相應(yīng)溶血素預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞。下列物質(zhì)中，不參與溶血反應(yīng)的是A.羊紅細(xì)胞B.抗紅細(xì)胞抗體C