教學(xué)課件-濁度法

1、微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定-濁度法濁度法什么是濁度法什么是濁度法 ？ 可用來測(cè)量菌濃度.其原理是發(fā)酵罐中的發(fā)酵液按照一定的流速進(jìn)入流通式比色皿中,用500-600nm的波長(zhǎng)檢測(cè)發(fā)酵液的光密度 。 一、濁度法一、濁度法 v 微生物細(xì)胞數(shù)量的增加稱為微生物群體生長(zhǎng) 。由于微生物個(gè)體微小的特殊性，難以針對(duì)單個(gè)微生物細(xì)胞或個(gè)體的生長(zhǎng)繁殖的研究進(jìn)行，故除特定的研究目的外，一般所言的微生物生長(zhǎng)是指群體生長(zhǎng)。 微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律 v以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以計(jì)數(shù)獲得的細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，可得到一條定量描述液體培養(yǎng)基中微生物生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，該曲線則稱為細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線（ growt

2、h curve ，見圖 ）。微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律 v細(xì)菌生長(zhǎng)曲線可劃分為四個(gè)時(shí)期，即： 延遲期， 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 穩(wěn)定期； 衰亡期。生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞及其群體在新的適宜的理化環(huán)境中，生長(zhǎng)繁殖直至衰老死亡的動(dòng)力學(xué)變化過程。生長(zhǎng)曲線各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)，反映了所培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞與其所處環(huán)境間進(jìn)行物質(zhì)與能量交流，以及細(xì)胞與環(huán)境間相互作用與制約的動(dòng)態(tài)變化。 微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律 v 微生物在適宜的環(huán)境條件下，不斷地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并按照自己的代謝方式進(jìn)行代謝活動(dòng)，如果同化作用大于異化作用，則細(xì)胞質(zhì)的量不斷增加，體積得以加大，于是表現(xiàn)為生長(zhǎng)。簡(jiǎn)單地說，生長(zhǎng)就是有機(jī)體的細(xì)胞組分與結(jié)

3、構(gòu)在量方面的增加。生長(zhǎng)與繁殖與細(xì)胞生長(zhǎng)量測(cè)量意義生長(zhǎng)與繁殖與細(xì)胞生長(zhǎng)量測(cè)量意義 v根據(jù)微生物的生長(zhǎng)曲線可以明確微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重大的指導(dǎo)意義。故根據(jù)對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)規(guī)律可以得到培養(yǎng)菌種時(shí)縮短工期的方法:接種對(duì)數(shù)期的菌種,采用最適菌齡，加大接種量，用與培養(yǎng)菌種相同組成的培養(yǎng)基。有如，根據(jù)穩(wěn)定期的生長(zhǎng)規(guī)律，可知穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期，也是最佳測(cè)定期，通過對(duì)穩(wěn)定期到來原因的研究還促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝技術(shù)的創(chuàng)建。生長(zhǎng)與繁殖與細(xì)胞生長(zhǎng)量測(cè)量意義生長(zhǎng)與繁殖與細(xì)胞生長(zhǎng)量測(cè)量意義 一、直接法v（1）測(cè)體積 v 它是一種較為粗放的方法，通常用于初步比較用。例如將待測(cè)培養(yǎng)液放在刻度離心管中

4、作自然沉降或進(jìn)行一定時(shí)間的離心，然后觀察沉降物的體積。v（2） 稱干重 v 采用離心法或過濾法測(cè)定，一般干重為濕重的10%20%。通過生長(zhǎng)量測(cè)定通過生長(zhǎng)量測(cè)定微生物生長(zhǎng)微生物生長(zhǎng)二、間接法v（1）生理指標(biāo)法 ：與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多，它們均可用作生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值v1） 測(cè)定細(xì)胞總含氮量來確定細(xì)菌濃度 大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%。總氮量與細(xì)胞粗蛋白的含量的關(guān)系可用（粗蛋白總量=含氮量%6.25）含氮量的測(cè)定方法有很多，常用凱氏定氮法。通過生長(zhǎng)量測(cè)定通過生長(zhǎng)量測(cè)定微生物生長(zhǎng)微生物生長(zhǎng)v 2）含碳量的：將少量生物材料混入1ml水或無機(jī)緩沖液中，用2m

5、l 2%重鉻酸鉀溶液在100下加熱30分鐘，冷卻后，加水稀釋至5ml，在580nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值（用試劑作空白對(duì)照，并用標(biāo)準(zhǔn)樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線），即可推算出生長(zhǎng)量。v 3）其它 磷、DNA、RNA、ATP和 N乙酰胞壁酸等的含量，以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖作基質(zhì)）、耗氧、粘度和產(chǎn)熱等指標(biāo)，均可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。通過生長(zhǎng)量測(cè)定通過生長(zhǎng)量測(cè)定微生物生長(zhǎng)微生物生長(zhǎng)v（2）比濁法 v微生物在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，由于原生質(zhì)含量的增加，引起培養(yǎng)物混濁度的增高。某一未知濃度的菌液在透射光下用肉眼與某一比濁管進(jìn)行比較，如果兩者的濁度相當(dāng)，即可目測(cè)出該菌液的大致濃度。v精確的測(cè)定，要用分光光度計(jì)進(jìn)行。

6、在可見光的450650nm波長(zhǎng)內(nèi)均可測(cè)定。通過生長(zhǎng)量測(cè)定通過生長(zhǎng)量測(cè)定微生物生長(zhǎng)微生物生長(zhǎng)一、直接法v直接法即是在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，其計(jì)數(shù)結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。v（1）比例計(jì)數(shù)法 v是一種粗放的計(jì)數(shù)方法。將已知顆粒（例如霉菌的孢子或紅細(xì)胞等）濃度的液體與待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，然后鏡檢各自的數(shù)目，求出未知菌液中的細(xì)胞濃度。通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)v（2）血球計(jì)數(shù)板法 v 計(jì)數(shù)一定容積中的細(xì)胞總數(shù)的常用方法，此法對(duì)細(xì)胞較大的酵母菌較為適用通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)二、間接法v是一種活菌計(jì)數(shù)法，其原理是活菌在液體培養(yǎng)基

7、中生長(zhǎng)繁殖使液體混濁，在固體培養(yǎng)基表面形成菌落，然后計(jì)數(shù)活菌的方法。v（1）平板菌落計(jì)數(shù)法 v標(biāo)準(zhǔn)方法將待測(cè)樣品稀釋，然后取適宜的稀釋度樣品與固體培養(yǎng)基混勻，凝固后培養(yǎng)，然后計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以樣品的稀釋度，即可計(jì)算出樣品的含菌數(shù)。 通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)v（2）液體稀釋法 v 對(duì)未知樣品作10倍系列稀釋。選適宜的3個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液各取5ml，接種到3組共15支液體培養(yǎng)基試管中，每管接入1ml，培養(yǎng)一定的時(shí)間后，計(jì)錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查MPN表，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)可計(jì)算出其中的活菌含量。通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)通過計(jì)數(shù)測(cè)定微生物生長(zhǎng)方 法應(yīng) 用 直接

8、法涂片染色法血球計(jì)數(shù)板法比濁法 可同時(shí)計(jì)數(shù)不同類型的 微生物數(shù)量，常用于牛奶、土壤中的細(xì)菌計(jì)數(shù)可用于不同類型微生物的計(jì)數(shù)微生物學(xué)分析，肉湯培養(yǎng)物或水懸浮液中的細(xì)菌數(shù)估計(jì) 間接法平皿菌落計(jì)數(shù)法液體稀釋法薄膜過濾計(jì)數(shù)法 食品、水、土 壤、醫(yī)學(xué)、衛(wèi)生以及培養(yǎng)物中的細(xì)菌計(jì)數(shù)因某種原因而不能用瓊脂平皿活菌計(jì)數(shù)時(shí)被采用，如牛奶等適用于量大而且含菌數(shù)很低的材料，如空氣、水等 測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)量定氮法測(cè) DNA法測(cè)定細(xì)胞干重法生理指標(biāo)測(cè)定法 主要用于代謝研究，適于細(xì)胞濃度高的樣品同上用于調(diào)查研究，適用于細(xì)胞濃度高的材料微生物學(xué)分析研究v一、準(zhǔn)備菌種： 將細(xì)菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)18h，另外準(zhǔn)備單菌落平板1塊濁度濁度法測(cè)定菌體量法測(cè)定菌體量v二、分組分為三個(gè)小組： 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基, 37 200rpm 取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm 取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm 每培養(yǎng)一小時(shí)取樣一次(2.5h,3.5h加測(cè)1次). 對(duì)照組測(cè)量起始pH,所有瓶子測(cè)量發(fā)酵9h結(jié)束測(cè)pH