分子試驗常用溶液配制

1、分子實驗常用溶液配制一 . 常用貯液與溶液1mol/L 亞精胺( Spermidine ) : 溶解 2.55g 亞精胺于足量的水中， 使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20C。1mol/L精胺(Spermine):溶解3.48g精胺于足量的水中，使終體 積為10ml。分裝成小份貯存于-20C。10mol/L乙酸胺(ammoniunacetate ):將77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔徑的濾膜過濾除菌。10mg/ml牛血清蛋白(BSA):加100mg的牛血清蛋白(組分 V或分子 生物學(xué)試劑級，無DNA酶)于9.5ml水中(為減少變性， 須將蛋白參加水中，而不是

2、將水參加蛋白)，蓋好蓋后，輕輕搖動， 直至牛血清蛋白完全溶解為止。不要渦旋混合。加水定容到 10ml， 然后分裝成小份貯存于-20C。1mol/L二硫蘇糖醇(DTT):在二硫蘇糖醇5g的原裝瓶中加32.4ml 水，分成小份貯存于-20C?；蜣D(zhuǎn)移100mg的二硫蘇糖醇 至微量離心管，加 0.65ml 的水配制成 1mol/L 二硫蘇糖醇溶液。8mol/L 乙酸鉀( potassium acetate ):溶解 78.5g 乙酸鉀于足量的 水中，加水定容到 100ml。1mol/L氯化鉀(KCl):溶解7.46g氯化鉀于足量的水中，加水定容 到 100ml。3mol/L 乙酸鈉( sodium a

3、cetate ):溶解 40.8g 的三水乙酸鈉于約90ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的 pH至5.2，再加水定容到100ml。0.5mol/L EDTA:配制等摩爾的 Na2EDT和 NaOH溶液0.5mol/L , 混合后形成EDTA的三鈉鹽?；蚍Q取186.1g的Na2EDTA?2H2和20g 的NaOH并溶于水中，定容至1L。1mol/L HEPES:將 23.8gHEPES溶于約 90ml 的水中，用 NaOH調(diào) pH6.8-8.2 ，然后用水定容至 100ml。1mol/L HCl :加 8.6ml 的濃鹽酸至 91.4ml 的水中。25mg/ml IPGT :溶解250mg的IPGT 異

4、丙基硫代-B -D-半乳糖苷于10ml水中，分成小份貯存于-20C。1mol/LMgCI2:溶解 20.3g MgCI2?6H2Of足量的水中，定容到 100ml。100mmol/L PMSF溶解174mg的PMSF苯甲基磺酰氟于足量的異 丙醇中，定容到10ml。分成小份并用鋁箔將裝液管包裹或貯存于-20C。20mg/ml蛋白酶K proteinase K:將200mg的蛋白酶L參加到9.5ml 水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容 到10ml，然后分裝成小份貯存于-20C。10mg/mlRnase 無 DNase DNase- free RNase :溶解 10mg的

5、胰 蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中pH 5.0 。溶解 后于水浴中煮沸15min,使DNA酶失活。用1mol/L的Tris HCl調(diào) pH至7.5，于-20C貯存。配制過程中要戴手套5mol/L氯化鈉NaCl:溶解29.2g氯化鈉于足量的水中，定容至100ml。10N氫氧化鈉NaOH :溶解400g氫氧化鈉顆粒于約0.9L水的燒杯中磁力攪拌器攪拌，氫氧化鈉完全溶解后用水定容至1L。10% SDS 十二烷基硫酸鈉：稱取 100gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含 0.9L 的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至 1L。 2mol/L 山梨糖醇 Sorbitol ：溶解

6、36.4g 山梨糖醇于足 量水中使終體積為 100ml。100%三氯乙酸TCA :在裝有500gTCA的試劑瓶中參加100ml水， 用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。稀釋液應(yīng)在臨用前配制2.5 % X gal 5-溴4 氯-3-吲哚B -半乳糖苷：溶解25mg的X gal 于 1ml 的二甲基甲酰胺 DMF, 用鋁箔包裹裝液管，貯存于 -20C。100X Denhardt 試劑Denhardt s regent 成分及終濃度 配制 100ml 溶液各成分的用量2%聚 蔗 糖 Ficoll ， 400 型 2%聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 PVP-402%BSA 組分 V水 2g2g2g加水至總體積為

7、 100ml , 依照上表稱取各組分，溶于水中定容。過濾 除菌及雜質(zhì)，分裝成小份于-20 C貯存。10X標準 DNA連接酶緩沖液standard DNA ligase buffer 粘 端、平端連接成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分的用量0.5mol/L Tris-HCl:5ml1mol/L 貯液 ,100mmol/L MgCl2:1ml 1mol/L 貯液,100mmol/L DTT:1ml 1mol/L 貯液,2mmol/L ATP: 200ul100 mmol/L 貯液 ,5mmol/L 鹽酸亞精胺可選 :50ul 1 mmol/L 貯 液,0.5mg/ml BS組分 V可選：0.

8、5ml 10 mg/mL 貯液，水：2.25ml 將配制好的緩沖液分裝成小份，貯存于-20C。100 mmol/L dNTP 溶液 dNTP solutions 可以購置到100mmol/L純dNTPs貯液，-80C可貯存至少6個月。10mmol/L dNTP 混合液成分及終濃度 配制 20ul 溶液各成分的用量10mmol/L dATP10mmol/L dCTP10mmol/L dGTP10mmol/L dTTP水 2ul 100 mmol/L dATP 貯液2ul 100 mmol/L dCTP 貯液2ul 100 mmol/L dGTP 貯液2ul 100 mmol/L dTTP 貯液1

9、2ul20PEG 8000/2.5M NaCl成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分的用量質(zhì)量濃度為 20聚乙二醇2.5mol/L 氯化鈉水 20g50ml 5 mol/L 氯化鈉 或 14.6g 固體氯化鈉補足 100ml加聚乙二醇于含有氯化鈉的燒杯中，加水至終體積100ml，用磁力攪拌器攪拌溶解。20X SSC成分及終濃度 配制 1L 溶液各成分的用量300mmol/L 檸檬酸三鈉二水3mol/L 氯化鈉水 88.2g175.3g補足 1L溶解檸檬酸三鈉二水和氯化鈉于約 0.9L 水中，加幾滴 1 0NNaOH溶液調(diào)pH為7.0，用水補足體積至1L。DEPC焦碳酸二乙酯處理水加100ul

10、 DEPC于 100ml水中，使DEPC勺體積分數(shù)為0.1 %。在37C 溫浴至少12h,然后在15 psi條件下高壓滅菌20min,以使剩余的DEPC失活。DEPC會與胺起反響，不可用DEPC處理Tris緩沖液。 甲酰胺 deionized formamide 直接購置或加 Dowex XG8 混合樹脂于裝有甲酰胺的玻璃燒杯中，用磁力攪拌器輕輕攪拌1h,可去除甲酰胺中的離子。經(jīng) Whatman 1號 濾紙過濾除去樹脂后分成小份，充氮氣于-80C貯存防止氧化。 磷酸緩沖液 phosphate buffer 按照下表所給定的體積， 混合 1 mol/L 的磷酸二氫鈉單堿和 1mol/L 磷酸氫二

11、鈉雙堿貯液，獲得所需pH的磷酸緩沖液。配制1 mol/L 的磷酸二氫鈉NaH2P04?H2O貯液：溶解138g于足量水中，使終體 積為1L;1mol/L磷酸氫二鈉Na2HPO貯液:溶解142g于足量水中 使終體積為 1L。1mol/L磷酸二氫鈉ml 1mol/L 磷酸氫二鈉ml 最終pH值877850815775735685625565510450390330280 123150185265 315375435490550610670720 6.06.16.26.36.46.56.66.76.86.97.07.17.2TE (用于懸浮和貯存DNA成分及終濃度 配制 100ml 溶液各成分的用量

12、10mmol/L Tris HCl1mmol/L EDTA水 1ml 1mol/L Tris-HCI ( pH7.4-8.0 , 25C)200ul 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)98.8mlTris 緩沖液( Tris-HCl buffer )將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH(25C下) 加一定量的濃鹽酸(11.6N)，用水調(diào)整終體積至1L。濃鹽酸的體積( ml) pH8.6142128.53846566671.376 9.08.88.68.48.28.07.87.67.47.2二. 電泳緩沖液、染料和凝膠加樣液電泳緩沖液50X Tris -乙酸

13、TAE緩沖液成分及終濃度 配制 1L 溶液各成分的用量2mol/L Tris 堿1mol/L 乙酸100 mmol/L EDTA水 242g57.1 ml 的冰乙酸 17.4 mol/L 200ml 的 0.5 mol/L EDTA pH 8.0 補足 1L5XTris -硼酸TBE緩沖液成分及終濃度 配制 1L 溶液各成分的用量445 mmol/L Tris 堿445 mmol/L 硼酸鹽10 mmol/L EDTA 水 54g27.5g 硼酸20 ml 的 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)補足 1L染料1溴酚藍( bromophenol blue )加 1g 水溶性鈉型溴酚藍

14、于 100ml 水中，攪拌或渦旋混合直到完全溶 解。1二甲苯青 FF(xylene cyanole FF )溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。10mg/ml 的溴化乙錠(ethidium bromide )小心稱取1g溴化乙錠，轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，加 100ml水，用磁力攪拌器攪拌直到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管，于4C貯存。凝膠上樣液( gel loading solutions )6X堿性凝膠上樣液(室溫貯存)成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量0.3 N 氫氧化鈉6 mmol/L EDTA18聚蔗糖 400 型0.15 溴甲酚綠0.25 二甲苯青 FF水 300ul 1

15、0N 氫氧化鈉120ul 0.5mol/L EDTA pH8.01.8g15mg25mg補足到 10ml6 X聚蔗糖凝膠上樣液室溫貯存成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量0.15 溴酚藍0.15 二甲苯青 FF5 mmol/L EDTA15聚蔗糖 400 型水 1.5ml 1 溴酚藍1.5ml 1 二甲苯青 FF100ul 0.5mol/L EDTA pH8.0 1.5g補足到 10ml6X溴酚藍/二甲苯青/聚蔗糖凝膠上樣液室溫貯存成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量0.25 溴酚藍0.25 二甲苯青 FF15聚蔗糖 400 型 水 2.5ml 1 溴酚藍 2.5ml 1 二甲

16、苯青 FF1.5g 補足到 10ml6X甘油凝膠上樣液4C貯存成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量0.15 溴酚藍0.15 二甲苯青 FF5 mmol/L EDTA50甘油水 1.5ml 1 溴酚藍1.5ml 1 二甲苯青 FF100ul 0.5mol/L EDTA pH8.0 3ml3.9ml6X蔗糖凝膠上樣液室溫貯存成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量0.15 溴酚藍0.15 二甲苯青 FF5 mmol/L EDTA40聚蔗糖水 1.5ml 1 溴酚藍1.5ml 1 二甲苯青 FF100ul 0.5mol/L EDTA pH8.0 4g補足到 10ml10 x十二烷基硫酸鈉

17、/甘油凝膠上樣液室溫貯存成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量0.2 溴酚藍0.2 二甲苯青 FF200 mmol/L EDTA0.1 SDS50甘油水 20mg20mg4ml 0.5mol/L EDTApH8.0100ul 10 SDS5ml補足到 10ml三. 常用培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基將以下組分溶解在 0.9L 水中：蛋白胨 10g酵母提取物 5g氯化鈉 10g如果需要用1N NaOH1ml調(diào)整pH至7.0，再補足水至1L。注: 瓊脂平板需添加瓊脂粉 12g/L, 上層瓊脂平板添加瓊脂粉 7g/L 。SOB培養(yǎng)基將以下組分溶解在 0.9L 水中:蛋白胨 20g酵母提取物 5g氯化鈉 0

18、.5g1 mol/L 氯化鉀 2.5ml用水補足體積到1L。分成100ml的小份，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻到 室溫后，再在每100ml的小份中加1ml滅過菌的1mol/L氯化鎂。SOC培養(yǎng)基成分、方法同SOB培養(yǎng)基的配制，只是在培養(yǎng)基冷卻到室溫后，除了 在每100ml的小份中加1ml滅過菌的1mol/L氯化鎂外，再加2ml滅 菌的1mol/L葡萄糖18g葡萄糖溶于足夠水中，再用水補足到100ml， 用 0.22um 的濾膜過濾除菌。TB培養(yǎng)基將以下組分溶解在 0.9L 水中：蛋白胨 12g酵母提取物 24g甘油 4ml各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60C,再加100ml滅菌的170mmol/L KH

19、2PO4/0.72mol/L K2HPO4勺溶液2.31g 的 KH2PO和 12.54gK2HPO4 溶在足量的水中，使終體積為 100ml。高壓滅菌或用0.22um的濾膜 過濾除菌。2X YT培養(yǎng)基將以下組分溶解在 0.9L 水中：蛋白胨 16g酵母提取物 10g氯化鈉 4ml如果需要用1N NaOH(1ml)調(diào)整pH至7.0，再補足水至1L。注：瓊脂平板需添加瓊脂粉 12g/L, 上層瓊脂平板添加瓊脂粉 7g/L 。YPD培養(yǎng)基將以下組分溶解在 0.9L 水中：蛋白胨 20g酵母提取物 10g葡萄糖 20g用水補足體積為 1L 后，高壓滅菌。建議在高壓滅菌之前，對色氨酸營養(yǎng)缺陷型每升培養(yǎng)

20、基添加1.6g色氨酸，因為YPD培養(yǎng)基是色氨酸 限制型培養(yǎng)基。為了配制平板，需要在高壓滅菌前參加 20g瓊脂粉。四. 常用抗生素氨芐青霉素( ampicillin )( 100mg/ml)溶解1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至 10ml。分裝成小 份于-20C貯存。常以25ug/ml50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng) 基。羧芐青霉素( carbenicillin)( 50mg/ml)溶解0.5g羧芐青霉素二鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20C貯存。常以25ug/ml50ug/ml的終濃度添加于生長培 養(yǎng)基。甲氧西林( methicillin )( 100mg/m

21、l)溶解1g甲氧西林鈉于足量的水中，最后定容至 10ml。分裝成小份于 -20C貯存。常以37.5ug/ml終濃度與100ug/ml氨芐青霉素一起添加 于生長培養(yǎng)基。卡那霉素( kanamycin)( 10mg/ml)溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20C貯存。常以10ug/ml50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。氯霉素( chloramphenicol )( 25mg/ml)溶解250mg氯霉素足量的無水乙醇中，最后定容至 10ml。分裝成小 份于-20C貯存。常以12.5ug/ml25ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng) 基。鏈霉素( streptom

22、ycin )( 50mg/ml)溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20C貯存。常以10ug/ml 50ug/ml的終濃度添加于生長 培養(yǎng)基。萘啶酮酸( nalidixic acid)( 5mg/ml)溶解50mg萘啶酮酸鈉鹽于足量的水中，最后定容至 10ml。分裝成小 份于-20C貯存。常以15ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。四環(huán)素( tetracyyline )( 10mg/ml)溶解100mg四環(huán)素鹽酸鹽于足量的水中，或者將無堿的四環(huán)素溶于無 水乙醇，定容至10ml。分裝成小份用鋁箔包裹裝液管以免溶液見光， 于-20C貯存。常以10ug/ml

23、 50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。幾種溶液的配制方法1、PBS:取 ZLI-9061 PBS 溶于 1000ml 的蒸餾水中，混勻，測 pH 值應(yīng)在7.27.4之間，假設(shè)偏離此范圍，請用 0.1N的HCL或NaOH調(diào)整。2、TBS：2.1 Tris 緩沖液配方：( 0.5 M pH7.6 )Tris (三羥甲基氨基甲烷) 60.57g1N HCL約 420ml雙蒸水加至 1000mlTris 緩沖液配制方法：先以少量雙蒸水(300500ml)溶解Tris，參加HCI后，用HCI (1N)或NaOH( 1N)將pH調(diào)至7.6， 最后雙蒸水加至1000ml。此 液為儲藏液，4C冰箱中保存。

24、2.2 TBS 配方：Tris-HCI 緩沖液( 0.5M pH7.6 )100mlNaCI8.59g (0.15mol/L)雙蒸水加至 1000mlTBS配制方法：先以少量雙蒸水溶解 NaCl，再參加Tris-HCl緩沖液，最后加 雙蒸水至1000ml，充分搖勻。3、枸櫞酸鹽緩沖液( Citrate buffer )：3.1 儲存液：A. 0.1M 枸櫞酸溶液：稱取 21.01g枸櫞酸C6H8O7?H20溶于 1000ml蒸餾水中。B. 0.1M枸櫞酸鈉溶液：稱取29.41g枸櫞酸鈉C6H5Na3O7?2H20 溶于1000ml蒸餾水中。3.2工作液：取9ml 0.1 _A液和41ml B液

25、參加450ml蒸餾水中，溶液pH值 應(yīng)為6.04、胰酶Trypsin :4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液：常用濃度為0.125%，即使用前將一滴試劑1胰酶溶液和三滴試 劑2胰酶稀釋液均勻混合1:3稀釋，那么可直接滴加使用。胰酶的 最終濃度可以根據(jù)使用者的要求進行調(diào)整，濃度范圍可以從0.05%1:10 稀釋至 0.25% 1:1 稀釋。4.2 ZLI-9010 胰蛋白酶：取0.05g或0.1g胰蛋白酶參加到100ml 0.05%或 0.1% pH7.8的 無水氯化鈣水溶液中，溶解即可。5、胃酶Pepsin:4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。我公司備有ZLI-9013胃蛋白酶消化

26、工作液，不需稀釋直接滴加使用，歡送選購6、DAB6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit使用前只需將試劑盒提供的 A、B、C三種試劑各一滴加至1ml 雙蒸水中，即可獲得1ml DAB工作液，簡單易用。6.1 ZLI-9030 DAB :6mgDA溶于 10mlTBS0.05M pH7.6，再參加 0.1ml 濃度為 3% 的H2O2過濾掉沉淀物，即可。7、AEC4mgAEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，參加14ml濃度為0.1M的醋酸緩 沖液pH5.2，然后參加0.15ml 3%H2O2過濾掉沉淀物。8 RIPA:1 x PBS 1%NP 40 0.5 sodium deoxychola

27、te , 0.1% SDS 此液體 可長期保存。以下抑制劑以儲存液方式保存，臨用前參加RIPA中。8.1 10mg/ml l/ml PMSF異丙醇溶液用量為 10l/ml 18.2 AprotininSigma產(chǎn)品，用量為 308.3 1000mM sodium orthova nadate 冷凍液l/ml用量為109、Blotto A :常規(guī)使用 1x PBS 5% milk , 0.05% Tween 20。10、Blotto B :與 Phosphotyrosine 抗體共用，1 x PBS 1%milk , 0.05% Tween20。 局部實驗中milk可完全去除，但可能引起背景增咼

28、。實驗室常用貯存液的配制參數(shù) 一、核酸及蛋白質(zhì)常用數(shù)據(jù)化合物 分子量 入maxpH7.0 1摩爾溶液pH7.0中入max時的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712常用核酸的長度與分子量核酸核苷酸數(shù)分子量入DNA48502 雙鏈環(huán)狀3.0 X 107pBR3224363 雙鏈2.8 X 10628SrRNA4800

29、1.6X10623SrRNA37001.2X10618SrRNA19006.1 X10519SrRNA17005.5X1055SrRNA1203.6X104tRNA 大腸桿菌752.5X1043常用核酸蛋白換算數(shù)據(jù)1重量換算1 卩 g=10-6g1pg=10-12g1ng=10-9g1fg=10-15g2分光光度換算：1A260雙鏈 DNA=5Qi g/ml1A260單鏈 DNA=3Qi g/ml1A260單鏈 RNA=4Qi g/ml3DNA摩爾換算：1 卩 g IQQbp DNA=1.52pmol=3.Q3pmol 末端1 卩 g pBR322 DNA=Q.36pmolIpmol IQQQ

30、bp DNA=Q.66 卩 gIpmol pBR322=2.8 卩 g1kb雙鏈DNA鈉鹽=6.6 x 1Q5道爾頓1kb單鏈DNA鈉鹽=3.3 x 1Q5道爾頓1kb單鏈RNA鈉鹽=3.4 x 1Q5道爾頓 4蛋白摩爾換算：IQQpmol分子量1QQ, QQQ蛋白質(zhì)=10卩gIQQpmol分子量5Q，QQQ蛋白質(zhì)=5卩gIQQpmol分子量1Q, QQQ蛋白質(zhì)=1卩g氨基酸的平均分子量 =126.7 道爾頓5蛋白質(zhì)/DNA換算：1kb DNA=333個氨基酸編碼容量=3.7 X 104MV蛋白質(zhì) 10, OOOMV蛋白質(zhì)=270bp DNA30, OOOMV蛋白質(zhì)=810bp DNA50,

31、OOOMV蛋白質(zhì)=1.35kb1OO, OOOMV蛋白質(zhì)=2.7kb DNA4常用蛋白質(zhì)分子量標準參照物1 高分子量標準參照2中分子量標準參照3低分子量標準參照肌球 蛋 白分 子量磷酸化酶 B 97, 4OO 碳酸酐酶 31, OO66, 2OO 大豆脻蛋肌球蛋白 212, OOO 牛血清白蛋白 白酶 21 , 5OO55, OOO抑3 -半乳糖甘酶B 116, OOO谷氨酶脫氫酶 制劑磷酸化酶 B 97, 4OO 卵白蛋白 42, 7OO 馬心肌球蛋 白16, 9OO牛血清白蛋白66,2OO醛縮酶4O,OOO溶菌酶 14,4OO過氧化氫酶57，OOO碳酸酐酶31，OOO肌球蛋白F18, 1O

32、O醛縮酶 4O, OOO 大豆脻蛋白酶 21, 5OO 肌球蛋白F2)6, 2OO溶菌酶14，4005.常用DNA分子量標準參照物入 DNA/Hind 皿入 DNA/EcoRI入 /Hind 皿 +EcoRIpBR322123/Hae 皿9416742151484051046557580449735048943615643426845880232248433530434642027353020272675756419042345112515842132123130 21226 21227587137519218974184118311247564125續(xù)上表pBR322/Hinf I x 17

33、4/Hinf I x 174/Haem x 174/Tap I16317261401353291451771311810781175506553100872404396500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072二、常用緩沖液1分子克隆常用緩沖液2磷酸緩沖液(1) 25C下O.1mol/L磷酸鉀緩沖液的配制pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml)5.8 8.591.56.013.286.86.219.280.86.427.8

34、72.26.638.161.96.8 49.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06.2225C下0.1mol/L 磷酸鈉緩沖液的配制pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8探:用蒸餾水將混合的兩種1mol/L

35、貯存液稀釋至 1000ml，根據(jù)Henderson-Hasselbalch 方程計算其 pH值： pH=pK+1g 質(zhì)子受體 / 質(zhì)子供體 在此，pK =6.86(25 C)。3電泳緩沖液測序凝膠加樣緩沖液98%去離子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青 FF0.025%溴酚藍甲酰胺： 許多批號的試劑級甲酰胺， 其純度符合使用要求， 無須再進 行處理。不過，一旦略呈黃色，那么應(yīng)用在磁力攪拌器上將甲酰胺與DowexXG8昆合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，并用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲酰胺分裝成小份，充氮存于-70C。 常用的電泳緩沖液緩沖液 使用

36、液 濃貯存液(每升)Tris-乙酸(TAE1 x： 0.04mol/L Tris-乙酸 50x： 242g Tris堿0.001mol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris- 磷酸( TPE)1x:0.09mol/L Tris -磷酸 10x:10g Tris堿0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸(1.679g/ml )40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris- 硼酸( TBE)a0.5x0.045mol/L Tris -硼酸5x： 54gTris 堿0.001mol/L EDTA 27.5 硼酸20m

37、l 0.5mol/L EDTApH8.0堿性緩沖液 b 1 x :50mmol/L NaOH 1 x ：5ml 10mol/L NaOH 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTApH8.0Tris- 甘氨酸 c 1 x :25mmol/L Tris5x:15.1g Tris250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸電泳級 pH8.3 0.1% SDS 50ml 10% SDS電泳級說明： TBE溶液長時間存放后會形成沉淀物，為防止這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5X溶液，出現(xiàn)沉淀后那么予以廢棄。以片都以1X TBE作為使用液即1: 5稀釋濃貯液進行瓊脂糖凝膠 電泳。但0.

38、5 x的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊 脂糖膠電泳都以 1： 10 稀釋的貯存液作為使用液。進行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小， 故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用1X TBE以提供足夠的緩沖容量。 堿性電泳緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。 Tris -甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。2x SDS凝膠加樣緩沖液：100mmol/L Tris?HCl6.8200mmol/L 二硫蘇糖醇 DTT4%SDS 電泳級0.2%溴酚藍 20%甘油不含DTT的2X SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應(yīng)在臨用前取 1mol/L 貯存液現(xiàn)加于上述緩沖液中。4凝膠加樣緩沖液緩沖液類型6X緩沖液貯存

39、溫度I 0.25%溴酚藍4C0.25%二甲苯青 FF40% (W/V蔗糖水溶液II 0.25溴酚藍室溫0.25%二甲苯青 FF15%聚 蔗糖(Ficoll400)皿0.25%溴酚藍4C0.25%二甲苯青 FF30%甘油水溶液IV 0.25%溴酚藍4C40%(W/ V蔗糖水溶液堿性加樣緩沖液 :300mmol/L NaOH6mmol/L EDTAV 18%聚蔗糖(Ficoll400)4C0.15%溴甲酚綠0.25%二甲苯青 FF使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保 DNA 均勻進入樣品孔內(nèi)； 使樣品呈現(xiàn)顏色， 從而使加樣操作更為便利， 含 有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽極泳動的染

40、料。 溴酚藍在瓊脂糖中移 動的速率約為二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。以 0.5 x TBF作電泳液時，溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動那么與長4kb的雙鏈線狀 DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%1.4%的范圍內(nèi)，這些對應(yīng)關(guān)系受凝 膠濃度變化的影響并不顯著。選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。 但是，對于堿性凝膠應(yīng)當使用溴 甲酚綠作為示蹤染料，因為在堿性 pH條件下其顯色較溴酚更藍為鮮5.各種pH值的Tris緩沖液的配制各種pH值的Tris緩沖液的配制所需pH值25C7. 145.77. 244.77. 343.47. 442

41、.07. 540.37. 638.57. 736.67. 834.57. 932.08. 029.28.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.00.1mol/L HCl 的體積某一特定 pH 值的 0.05mol/L Tris 緩沖液的配制：將 50ml 0.1mol/LTris堿溶液與上表所示相應(yīng)體積(單位：ml)的O.1ml/L HCI混合,加水將體積調(diào)至 100ml(2)溫度對50mmol/L Tris?HCI液pH值的影響4C25C37C8 175728 276738 377748 478758 579768

42、 680778 781788 882798 983809 084819 185829 286839 387849 48885(6)常用緩沖液的pKa值 緩沖液 分子量 pKa值 緩沖范圍Trisa12.18.087.1 7.9HEPESb283.37.477.2 8.2MPOSc209.37.156.6 7.8PIPESd304.36.766.27.3MESe195.26.095.46.8a：三羥甲基氨基甲烷；b: N-2-羥乙基哌嗪-N -2-乙磷酸；c: 3- N-嗎啉代丙磺酸；d: N, N -雙2-乙磺酸哌嗪；e： 2- N- 嗎啉代乙磺酸。7溫度對常用緩沖液 pH 的影響-0.280

43、緩沖體系pKa20C pKa/10CMes6.15-0.110Ada6.60-0.110PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine 8.40三、常用酶的配制1溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20C。每 一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。2蛋白水解酶類貯存液 貯存溫度 反響濃度 反響緩沖液 溫 度 預(yù)處理0.01mol/L Tri

44、s(pH7.8)鏈霉蛋白酶a20mg/ml-20C(溶于水)1mg/ml0.01mol/L EDTA37 C自消化b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶Kc20mg/ml-20C(溶于水)50 卩 g/ml0.005mol/L EDTA37 56 C無須預(yù)處理0.5% SDSa：鏈霉蛋白酶是從鏈球菌(Streptomyces griseus )中別離到的一 種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。b:自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，經(jīng)自消化的鏈酶蛋白酶的 配制方法如下：把該酶的粉末溶解于 10mmol./L Tris?HCl(pH7.5) 、 10mmol/L NaC

45、l中，配成20mg/ml濃度，于37C溫育1h。經(jīng)消化的 鏈霉蛋白酶分裝成小份放在密封試管中，保存 -20C。c：蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌( Tritirachium album Limber )中純化得到。該酶有兩個 Ca2+ 結(jié)合位點， 它們離酶的活性中心有一定距離， 與催化機理并無直接關(guān) 系。然而，如果從該酶中除去 Ca2+由于出現(xiàn)遠程的結(jié)構(gòu)變化，催 化活性將喪失 80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下 污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶K消化過程中通常參加EDT(以 抑制依賴于 Mg2+勺核酸酶的作用)。但是，如果要消化對蛋白酶K具有較強耐

46、性的蛋白，如角蛋白一類，那么可能需要使用含有 1mmol/L Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要參加EGT(pH8.0)至終濃度為2mmol/L,以鰲合Ca2+。3. 無DNA酶的RNA酶將胰 RNAB( RNA酶 A)溶于 10mmol/L Tris?HCI(pH7.5)、15mmol/L NaCI中，配成10mg/ml的濃度，于100C加熱15min,緩慢冷卻至室 溫，分裝成小份保存于-20 C。四、常用抗生素溶液抗生素 貯存液 a 工作濃度濃度保存條件嚴緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒氨芐青霉素50mg/ml(溶于水)-20C20卩g/ml60 卩 g/ml羧芐青霉素50mg/

47、ml(溶于水)-20C20卩g/ml60 卩 g/ml氯霉素34mg/ml(溶于乙醇-20C25 卩 g/ml170 卩 g/ml卡那霉素10mg/ml(溶于水-20C10 卩 g/ml50 a g/ml鏈霉素10mg/ml( 溶于水 )-20C10a g/ml50ag/ml四環(huán)素b5mg/ml(溶于乙醇-20C10 卩 g/ml50a g/mla：以水為溶劑的抗生素貯存液通過 0.22卩m濾器過濾除菌。以乙醇 為溶劑的抗生素溶液無須除菌處理。 所有抗生素溶液均應(yīng)放于不透光 的容器保存。b:鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應(yīng)使用不含鎂鹽 的培養(yǎng)基如 LB 培養(yǎng)基。五、常用貯存液的配制

48、130%丙烯酰胺溶液【配制方法】將29g丙烯酰胺和1g N, N -亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為 60ml的 水中。加熱至37C溶解之，補加水至終體積為 100ml。用Nalgene 濾器0.45卩m孔徑過濾除菌，查證該溶液的 pH值應(yīng)不大于7.0 , 置棕色瓶中保存于室溫。【注意】 丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收,其作用具累積 性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具。 可認為聚丙 烯酰胺無毒,但也應(yīng)謹慎操作,因為它還可能會含有少量未聚合材料。一些價格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子， 在丙 烯 酰 胺 貯 存 液 中 加 入 大 約 0.2 體 積 的 單

49、 床 混 合 樹 脂 MB-1Mallinckrodt ，攪拌過夜，然后用 Whatman1 號濾紙過濾以純化之。 在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯 酸。240%丙烯酰胺【配制方法】把380g丙烯酰胺DNA測序級和20g N, N -亞甲雙丙烯酰胺溶于 總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30%烯酰胺溶液的方 法處理,但加熱溶解后應(yīng)以蒸餾水補足至終體積為 1L?！咀⒁狻恳娚鲜雠渲?0%丙烯酰胺的說明，40噴烯酰胺溶液用于 DNA序列測 定。3.放線菌素D溶液【配制方法】把20mg放線菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1: 10稀釋貯存液，用 100%醇作空白

50、對照讀取 OD440。放線菌素D 分子量為1255純 品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為 21,900,故而1mg/ml的放線菌素D 溶液在440nm處的吸光值為0.182 ,放線菌素D的貯存液應(yīng)放在包有 箔片的試管中，保存于-20C?！咀⒁狻糠啪€菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實驗桌面上進行， 謹防吸入藥粉或讓其接觸 到眼睛或皮膚。藥廠提供的作治療用途的放線菌素 D制品常含有糖或鹽等添加劑。只 要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素 D的濃度， 這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用。4. 0.1mol/L腺苷三磷酸ATP溶液【配制方法】在0

51、.8ml水中溶解60mg ATP用0.1mol/L NaOH調(diào)至pH值至7.0 ,用蒸餾水定容1ml,分裝成小份保存于-70C5. 10mol/L 乙酸酰溶液【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。6. 10%過硫酸銨溶液【配制方法】把1g過硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4C保存數(shù)周。7. BCIP溶液【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽BCIP溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4C8. 2X BES緩沖鹽溶液【配制方法】用總體積90ml的蒸餾水溶解1.07g鹽溶液BESN, 2雙2-羥乙基-2-氨基乙磺酸、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4室溫下用HCI調(diào) 節(jié) 該溶液的pH值至6.96、然后參加蒸餾水定容至100ml,用0.22卩m 濾器過濾除菌，分裝成小份，保存于-20C。91mol/L CaCl2 溶液【配制方法】在200ml蒸餾水中溶解54g CaCI2?6H2O用0.22卩m濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于-20C。【注意】制備感受態(tài)細胞時，取出一小份解凍并用蒸餾水稀釋至100ml，用Nalg