清熱化濕3方對大鼠免疫性肝損傷治療作用的對比觀察

1、    清熱化濕3方對大鼠免疫性肝損傷 治療作用的對比觀察        摘要：用BSA(小牛血清白蛋白)復(fù)制大鼠免疫性肝損傷模型，應(yīng)用清熱化濕3方進(jìn)行治療，觀察形態(tài)學(xué)與肝功能生化學(xué)、肝纖維化指標(biāo)。結(jié)果表明：(1)3方均可降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及透明質(zhì)酸(HA)；(2)甘露消毒丹對血清前膠原肽(PC)、甘膽酸(CG)均有效；茵陳蒿湯降CG效果較好，而茵陳四苓散降PC作用較佳；(3)光鏡、電鏡結(jié)果顯示：甘露消毒丹能較好治療肝纖維化；茵陳四苓散次之；茵陳蒿湯對肝纖維化

2、治療作用較差。關(guān)鍵詞：甘露消毒丹；茵陳蒿湯；茵陳四苓散；免疫性肝損傷；肝纖維化中分類號：文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1000-5633(2000)02-0018-04 甘露消毒丹(以下簡稱甘方)、茵陳蒿湯(以下簡稱茵方)、茵陳四苓散(以下簡稱茵四方)是治療病毒性肝炎濕熱證的常用方，筆者在臨床上辨證使用3方均獲得很好的療效1。本實驗從形態(tài)學(xué)、肝功能生化學(xué)及肝纖維化指標(biāo)方面，觀察清熱化濕3方護(hù)肝、抗肝纖維化作用，從而為臨床療效提供實驗依據(jù)。1材料與方法1.1實驗動物Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重(130±10) g，由湖南中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.2試劑及藥物(1)不完全弗氏佐

3、劑：由無水羊毛脂(上海油脂三廠，批號801102)與液體石臘(南昌揚(yáng)子洲制藥廠，批號980226)按35比例配制，高壓滅菌，4 保存?zhèn)溆谩?2)牛血清白蛋白(BSA)：電泳純，德國產(chǎn)品，上海市生物化學(xué)試劑公司分裝，批號9801108。(3)甘露消毒丹、茵陳蒿湯、茵陳四苓散藥材均購于湖南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房。1.3造模方法隨機(jī)選取16只大鼠作為正常對照組，剩余84只大鼠按照文獻(xiàn)2的方法對其進(jìn)行BSA造模。1.4分組及給藥造模成功后，先將56只雌雄大鼠按體重分層，然后隨機(jī)分為造模對照組、甘露消毒丹組(甘方組)、茵陳蒿湯組(茵方組)、茵陳四苓散方組(茵四方組)，每組14只大鼠。3方藥量依方劑學(xué)

4、規(guī)劃教材按動物體表面積與成人用量折合加大3倍配制。常規(guī)浸泡煎煮，濃縮成分別含甘露消毒丹0.9 g/ml、茵陳蒿湯0.24 g/ml、茵陳四苓散0.49 g/ml的藥液。治療組以1 ml/(100 g.d)灌胃，正常對照組、造模對照組以溫開水1 ml/(100 g.d)灌胃，共2個月。療程結(jié)束后，采用乙醚麻醉、頸動脈插管取血及取肝組織備檢。1.5檢測指標(biāo)及方法肝功能以日立7170型全自動生化分析儀分別測定，由湖南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生化室完成。血清HA、LN用RIA法，試劑盒由海軍研究所提供；血清CG、PC用RIA法，試劑盒分別由北京原子能研究所和重慶腫瘤研究所提供。由附屬第一醫(yī)院放免中心完成。

5、肝組織光鏡觀察標(biāo)本：取右葉，以10%甲醛固定。肝組織電鏡觀察標(biāo)本：取右葉，用鋒利刀片將邊緣修齊，取5 mm×1 mm×1 mm的組織塊以2.5%戊二醛固定。分別由湖南中醫(yī)學(xué)院病理檢驗室及湖南醫(yī)科大學(xué)電鏡室完成。1.6統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用方差分析，兩兩比較用q檢驗。2結(jié)果2.1各組大鼠肝功能結(jié)果各治療組大鼠肝功總蛋白(TPR)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(r-GT)、總膽紅素(TBIl)、直接膽紅素(DBIl)、間接膽紅素(IBIl)、總膽汁酸(TBA)與造模組比較差異無顯著性(P0.05)。ALT、白蛋白(ALB)、AKP、r-GT結(jié)果見表1

6、。組別nALT(u/L)ALB(g/L)AKP(u/L)r-GT(u/L)對照組12模型組11甘方組8茵方組9茵四方組8F(方差齊性)3.6653.9972.7653.339P-Value0.0120.0080.0390.018F crit2.5892.5882.5882.589     注：與模型組比較P0.05，P0.01。2.2各組大鼠HA、PC、LN、CG的含量變化 各治療組大鼠層粘連蛋白與造模組比較差異無顯著性(P0.05)。HA、PC、LN、CG結(jié)果見表2。組別nHA(ng/ml)PC (g/L)LN(ng/ml)CG(g/L)對照組11模型

7、組9甘方組8茵方組9茵四方組8F(方差齊性)3.2993.9265.7332.872P-Value0.0200.0090.0010.036F crit2.6062.6062.6062.606     注：與模型組比較P0.05，P0.01；與正常組比較P0.05。 2.3各組大鼠光鏡、電鏡觀察對照組光鏡：肝組織內(nèi)小葉無間隔，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，見1-1。電鏡：肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，胞質(zhì)內(nèi)線粒體、糖原及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，肝細(xì)胞內(nèi)可見核染色質(zhì)呈塊狀散在分布，見1-2。    1-1、1-2正常對照組，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，

8、肝組織內(nèi)小葉無間隔，肝細(xì)胞呈放射狀排列，胞質(zhì)內(nèi)線粒體、糖原及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。模型組光鏡：匯管區(qū)有大量纖維組織增生，呈寬帶狀，有假小葉形成，見2-1。電鏡：肝膜面增寬，肝細(xì)胞皺縮，膽小管結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體減少，胞質(zhì)內(nèi)可見成束的膠原纖維，肝竇旁及狄氏間隙內(nèi)有大量膠原纖維和纖維母細(xì)胞，并有炎性細(xì)胞浸潤，見2-2。    2-1、2-2造模對照組，大量纖維組織增生，呈寬帶狀，有假小葉形成。肝細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)內(nèi)可見成束的膠原纖維。甘方組光鏡下未見纖維增生，見3-1。電鏡下肝膜面稍寬，膽小管擴(kuò)張，管內(nèi)微絨毛脫落，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富，大多數(shù)線粒體嵴較明顯，膠原纖

9、維很少，可見大小不等的脂滴，見3-2。    3-1、3-2甘露消毒丹組，光鏡下未見纖維增生，電鏡下肝細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富，膠原纖維很少，可見大小不等脂滴。茵方組光鏡：有較多纖維增生，較造模組少，呈窄帶狀，形成不完全間隔，見4-1。電鏡：肝細(xì)胞內(nèi)線粒體較豐富，但結(jié)構(gòu)模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，大小不等脂滴較多，肝竇擴(kuò)張，竇旁可見成束的膠原纖維，狄氏間隙增寬，間隙內(nèi)貯脂細(xì)胞、膠原纖維、纖維母細(xì)胞大量增生，膽小管結(jié)構(gòu)不清晰，見4-2。    4-1、4-2茵陳蒿湯組，有較多纖維增生，呈窄帶狀，形成不完全間隔。肝細(xì)胞內(nèi)線粒體較豐富

10、，但結(jié)構(gòu)模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴較多。茵四方組光鏡：少量膠原纖維增生，中央靜脈和門靜脈區(qū)有少量纖維索放散延伸，但無間隔形成，見5-1。電鏡：肝細(xì)胞內(nèi)線粒體較豐富，結(jié)構(gòu)不清晰，部分線粒體空泡變，核膜完整，核仁明顯，膽小管結(jié)構(gòu)清晰，部分肝竇擴(kuò)張，竇旁可見束狀膠原纖維。肝纖維化程度介于茵方與甘方之間，見5-2。    5-1、5-2茵陳四苓散組，少量膠原纖維增生，無間隔形成，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體較豐富，結(jié)構(gòu)不清晰，部分線粒體空泡變，核模完整，核仁明顯3討論3.13方對ALT、HA的相同作用清熱化濕3方臨床適用于有濕重、熱重、濕熱并重之別的病毒性肝炎，對肝功能指標(biāo)的改善

11、也各有側(cè)重1。本實驗將3方作用于同一模型，對ALT、HA均有效，是否提示只要有護(hù)肝作用的方劑，就能降A(chǔ)LT，以往研究也證實，用不同疏肝方作用于同一動物模型，均有不同程度的降A(chǔ)LT的作用，而對AST等指標(biāo)的作用則不盡相同3。鄭若玄等分別用上述3方作用于不同動物模型，同樣也有降A(chǔ)LT作用46，這就表明不論是不同的治肝病方作用于同一模型，還是相同的治肝病方作用于不同模型均能降A(chǔ)LT，提示ALT這一肝功指標(biāo)可能不是中醫(yī)辨證在動物模型中以方測證的特異性指標(biāo)。至于該實驗中3方還能降HA，可能因為HA水平與肝纖維化有密切的關(guān)系，且與血清ALT活性呈正相關(guān)7，故3方降低ALT的同時也降低HA。3.23方對CG

12、、PC的不同影響清熱化濕3方中的甘露消毒丹臨床用于濕熱并重型肝病患者，茵陳蒿湯用于熱重于濕，茵陳四苓散用于濕重于熱者。本研究結(jié)果顯示：甘露消毒丹對CG、PC均有效，而茵陳蒿湯對CG有作用，茵陳四苓散只對PC有效，這一結(jié)果提示CG、PC這2項指標(biāo)對中醫(yī)辨證濕與熱分型有一定的參考意義。以方測指標(biāo)，茵陳蒿湯對CG有作用，那么CG可能與“熱”的病理有關(guān)，如果臨床上以CG升高為主，用藥則選苦寒清熱為主；茵陳四苓散對PC有效，那么PC則可能與濕的病理相關(guān)，如果臨床以PC升高為主，用藥則多選利濕藥，如果CG、PC均升高，治療則清熱化濕并重。既往研究亦發(fā)現(xiàn)茯苓有利水滲濕之功，不僅臨床治療肝硬變腹水取得良好療效

13、，同時可促進(jìn)實驗性肝硬變動物肝臟膠原蛋白降解，使肝內(nèi)纖維組織重吸收8。恰好茵陳四苓散中有茯苓、豬苓等利水滲濕之品，甘露消毒丹中雖無茯苓，但亦有滑石、木通等淡滲利水之品，故2方均能降低PC，而茵陳蒿湯中無上述淡滲之品，則對PC無效。3.33方對大鼠肝臟形態(tài)學(xué)影響本研究電鏡、光鏡結(jié)果顯示：甘露消毒丹對肝纖維化有較好的治療作用，茵陳四苓散次之，茵陳蒿湯則作用較差，這與上述3方對PC的不同作用有關(guān)。型膠原為肝組織中主要膠原之一，在肝纖維化時顯著增多，PC反映型膠原合成水平和纖維增生程度加重，恰好甘露消毒丹、茵陳四苓散能有效降低PC，同時這兩方又對肝纖維化模型治療也確有作用，茵陳蒿湯因?qū)C作用不及甘露

14、消毒丹和茵陳四苓散，所以對肝纖維化的作用也不及上述3方。其次可能還與甘露消毒丹、茵陳四苓散能有效的清除循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)，同時抑制CIC激活補(bǔ)體作用有關(guān)。茵陳蒿湯則無抑制CIC、清除補(bǔ)體的作用?？赡芘c免疫復(fù)合物可激活補(bǔ)體，損傷局部組織，加重炎癥反應(yīng)，加重肝纖維化有關(guān)。湖南省衛(wèi)生廳中醫(yī)管理局重點(diǎn)資助項目（編號 98002）趙國榮（1955-）女，山西襄垣人，湖南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院副教授、副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)溫病及肝病的研究。趙國榮（湖南中醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）曹軍連（湖南中醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）劉近明（湖南中醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）盧岳華（湖南醫(yī)藥?？茖W(xué)校，湖南 長沙410005）參考文獻(xiàn)：1趙國榮，賀又舜，劉慶田，等.辨證治療病毒性肝炎肝功能損害295例療效分析J.湖南中醫(yī)雜志.1998，14(1)：1112.2朱啟貴，方步武，竺稽能，等.牛血清白蛋白免疫性肝纖維化動物模型的研究J.中華病理學(xué)雜志，1993，22(2)121.3趙國榮，劉近明，李承哲，等.四逆散、逍遙散及其配伍丹參或桃仁對大鼠免疫性肝損傷影響的對比研究J.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報.1999，19(4)：911.4