Transwell是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)方法.資料

1、Transwell是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)方法我們所使用的是Chemicon公司的ECM554,基質(zhì)膠已經(jīng)包被好了，買來(lái)就可以用, 很方便，而且我彳門算過(guò)，跟自己買膠來(lái)包被價(jià)格相差不大。這種膠 4度下很軟,37度則 變得比較堅(jiān)硬，因此用前應(yīng)先放在培養(yǎng)箱中10分鐘作用，使膠完全凝固。該試劑盒對(duì)穿過(guò)膜的細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，再用裂解液裂解細(xì)胞后檢測(cè)熒光值。我們?cè)趯?shí)際使用的時(shí)候?qū)Υ┻^(guò)膜的細(xì)胞采用1%結(jié)晶紫染色，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。結(jié)晶紫也可以用33%醋酸溶解，再用酶標(biāo)儀570nm檢測(cè)，同樣可以反應(yīng)穿過(guò)細(xì)胞數(shù)因?yàn)榛|(zhì)膠的厚度直接影響穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，因此建議有條件的話還是買這類 已經(jīng)鋪好膠的試劑盒，比較可靠。

2、說(shuō)明書該公司網(wǎng)上可以下載，對(duì)原理也有比較詳細(xì)的闡述，可以去查一下。我們做的時(shí)候，上室用0.5%BSA的培養(yǎng)液，下室用5%血清的培養(yǎng)液，下室血清的 濃度可根據(jù)細(xì)胞類型的不同進(jìn)行調(diào)整，如果細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，可適當(dāng)降低血清濃度，否 則可適當(dāng)提高血清濃度。需要注意的是：1。上室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目要適當(dāng)，過(guò)多,穿過(guò)膜的細(xì)胞會(huì)過(guò)多過(guò)快，如果用計(jì)數(shù)法的 話將難以計(jì)數(shù)；最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有細(xì)胞存在。具體細(xì)胞密度 需要自己摸索。2。細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性對(duì)結(jié)果影響很大，各組間最好不要分開計(jì)數(shù)。盡量用同一 密度的細(xì)胞懸液給予不同處理，保證各組細(xì)胞量一致3。對(duì)細(xì)胞的處理不可影響細(xì)胞生存。否則難以肯定是細(xì)胞量的改

3、變還是侵襲能力改變侵襲小室其實(shí)不止是transwell的,其它像Boyden chamber Thincert也挺好用 的。我用過(guò)Thincert,個(gè)人感覺(jué)不錯(cuò)，而且價(jià)格便宜，是grelner的，孔徑8微米用于24 孔板的一個(gè)才45塊人民幣，而且可以零買，不想transwell,總是一箱一箱的賣，實(shí)在是 太貴了！侵襲實(shí)驗(yàn)要結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，不一定非要包被的。下面奉上用Thincert做侵襲實(shí)驗(yàn)的步驟(摘自A quantitative cell migration assay using ThinCert? cell culture inserts，大家如需要，可用 google搜之：1. Prep

4、are cell cultures according to standard cell culture procedures2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA3. Harvest cells and wash them twice in PBS4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml5. Place 24 well ThinCe

5、rtTM cell culture inserts in the wells of a CELLSTAR? 24 well cell culture plate6. Add 600 l culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate7. Add 200 l cell suspension to each cell culture insert8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture in

6、cubator at 37C and 5 % CO29. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 l serum-free culture medium with 8 M Calcein-AM10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO211. Remove the culture medium from the cell culture inserts1

7、2. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 l prewarmed Trypsin-EDTA per well13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO2, ag itate the plate from time to time14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 l

8、of the Trypsin-EDTA solution （now containing the migratory cells from each well into a black flat bottom 96 well plate15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm從第9步開始計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞時(shí)，這份說(shuō)明書用的是熒光標(biāo)記，但這種方法成本高 而且繁瑣。我做的時(shí)候改為giemsa染

9、色,發(fā)現(xiàn)效果不錯(cuò)，具體如下：9 .侵襲實(shí)驗(yàn)完成后，取出小室，用棉簽小心將膜上表面的細(xì)胞擦拭去除；10 用手術(shù)刀片小心沿小室邊緣將膜切下；11 .把膜下表面向上放在一個(gè)潔凈的24孔板的孔中；12 .甲醇:冰醋酸（3:1固定10min后用10%giemsa染色;13 .在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞（即染成紫紅色的點(diǎn)，未著色的多為細(xì) 胞碎屑計(jì)數(shù)并拍照留念Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)概述目的:總結(jié)并改進(jìn)細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的操作經(jīng)驗(yàn)。方法：采用改進(jìn)后細(xì)胞體外侵 襲實(shí)驗(yàn)分別研究不同濃度TNFa刺激下的HCCC29810膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱;粉防己堿對(duì)HUVEC人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的

10、抑制作用；VEGF對(duì)人結(jié) 腸癌HT229細(xì)胞體外侵襲能力的影響。結(jié)果：改進(jìn)后侵襲試驗(yàn)定位準(zhǔn)確，結(jié)果清晰。 結(jié)論:按照作者建議的方法操作，能夠縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，有助于提高細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的 質(zhì)量。細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于各種細(xì)胞因子對(duì)惡性月中瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影 響及一些抑制血管生成的新藥研究，但在具體實(shí)驗(yàn)中獲得真實(shí)、最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖 像,并借以說(shuō)明問(wèn)題并非簡(jiǎn)單。很多研究人員在此方面花費(fèi)了很多時(shí)間和科研經(jīng)費(fèi)，從刺激實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞到蘇木素染色，看似簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)步驟中有很多環(huán)節(jié)需要研究者注意.材料與方法1.1Matrigel:Becton Dickinson Compary, - 20 C 保存；Tans

11、well plate:Costar ,USA , # 3422 聚碳酯膜微孔直徑為 8 pm;蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。1.2 趨化因子的制備取傳代第二天長(zhǎng)勢(shì)良好的NIH3T3細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基輕柔漂洗兩次；加入無(wú)血清培養(yǎng)基，37C ,5 %CO2培養(yǎng)24 h48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清;4 C,12 000rpm離心,10 min，取上清;0.22 11m膜過(guò)濾除菌；分裝，在-20 C保存。1.3transwell培養(yǎng)板準(zhǔn)備所有操作均需無(wú)菌操作。-20C保存的Matrigel在冰上保 2C8c過(guò)夜融化。在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取100仙l Matrige加入冰預(yù)冷的300 比血清培養(yǎng)基中，充分

12、混均。取上述稀釋的 Matrigel 25 加入transwell板上室，覆蓋整 個(gè)聚碳酯膜,37 ,30 min，使Matrigel聚合成膠。已鋪好 Matrigel的transwell培養(yǎng) 板置于37c可保存2周。1.4Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)（Matrigel Invasion Assay刺激后的各組細(xì)胞用 PBS漂洗3 次。以常規(guī)方法用無(wú)血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，5 105個(gè)細(xì)胞/ ml,每組細(xì)胞各分為兩部分。胎盤蘭拒染實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞活力需大于95 %。Transwell培養(yǎng)板上室加入 100仙細(xì)胞懸液（5 1處4個(gè)并加入無(wú)血清培養(yǎng)基200 ul。Transwell培養(yǎng)板下室加入 500小

13、晅化因子,37 C ,5 %CO2培養(yǎng)24 h。用濕棉簽輕輕擦去 Matrigel凝膠和聚碳酯 膜上表面的細(xì)胞。小心取出上室，用線拴住，并做好標(biāo)記,用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。梯度乙醇脫水（80 % ,95 % ,100 %二甲苯透明。小心將聚 碳酯膜自上室基底切取下來(lái)，置載玻片上中性樹脂封片。附著于聚碳酯膜下表面的 細(xì)胞在高倍鏡下（400隨機(jī)取6個(gè)視野1 計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次。注意事項(xiàng)2. 1NIH3T3細(xì)胞制備的趨化因子與胎牛血清趨化因子是能使細(xì)胞產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)的一類細(xì)胞因子2 。目前利用NIH3T3細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體 外侵襲實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室比較多，時(shí)間較

14、長(zhǎng)且實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣。眾所周知，胎牛血清中有趨化因子，我們?cè)诓煌瑵舛萒NFa刺激下的HCCC29810膽囊癌細(xì)胞 體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用胎牛血清和用NIH3T3細(xì)胞制備的趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)效果是一樣的，兩組遷移的細(xì)胞數(shù)很接近。在實(shí)驗(yàn) 時(shí)間上用NIH3 T3細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為1周，而用胎牛血清作趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為2d，實(shí)驗(yàn)時(shí)間節(jié)省了很多。因此認(rèn)為可以用胎牛血清來(lái)代替NIH3T3細(xì)胞制備的趨化因子。2. 2細(xì)胞的準(zhǔn)備所需細(xì)胞應(yīng)處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞活力需大于95 %。如果細(xì)胞 活力小，就會(huì)造成細(xì)胞穿透能力下降，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. 3擦去Matrigel

15、凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞先用干棉簽將上室內(nèi)液體吸去再用蒸儲(chǔ)水浸濕的棉簽輕輕擦去 Mat rigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞，如果沒(méi)有 擦凈聚碳酯膜上表面的細(xì)胞，在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)就會(huì)將沒(méi)擦掉的細(xì)胞也計(jì)進(jìn)來(lái)。尤其是 細(xì)胞為圓形的時(shí)候，就會(huì)分辨不出是穿過(guò)去的細(xì)胞還是沒(méi)穿過(guò)去的細(xì)胞 ，對(duì)于長(zhǎng)梭形 細(xì)胞來(lái)說(shuō)，穿過(guò)去的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，沒(méi)穿過(guò)去的細(xì)胞多為圓形。2. 4蘇木素染色上室浸泡在新蘇木素中的時(shí)間為1 min，用過(guò)多次的蘇木素為2min。在研究粉防己堿對(duì)HUVEC人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的抑制作用沒(méi)有將 多余蘇木素洗去，直接脫水、透明，造成細(xì)胞圖片背景模糊，細(xì)胞不清楚。在作不同濃 度TNFa刺激下的HCCC29810膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)時(shí)我們將其置 于盛有自來(lái)水的燒杯中，反復(fù)漂洗幾次，將多余蘇木素洗去再行脫水、透明；這樣做出 的細(xì)胞圖片背景干凈，細(xì)胞清楚。2. 5脫水和透明時(shí)間脫水時(shí)間各為1 min，在二甲苯中的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，以2 min3