嗅鞘細(xì)胞介紹1

1、嗅鞘細(xì)胞簡介嗅鞘細(xì)胞是目前所發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以再生的細(xì)胞之一。 其特點(diǎn)為終 身具有神經(jīng)再生功能 ,還能夠釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)粘附分子 ,被認(rèn)為是髓 鞘化能力最強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞。 逐漸用于治療脊髓損傷。 嗅鞘細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞、 許旺 細(xì)胞在表現(xiàn)型上有共同點(diǎn)， 它們都能促進(jìn)軸突的再生， 主要區(qū)別在于嗅鞘細(xì)胞不 但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)， 也存在于外周神經(jīng)中。 嗅黏膜中的神經(jīng)元是唯一生后才 生長并在成年時(shí)繼續(xù)分化的神經(jīng)元， 壽命為412周，隨著新細(xì)胞的生長，又建 立了新的神經(jīng)支配關(guān)系。 嗅鞘細(xì)胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層上， 沿嗅神經(jīng)的 全長，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。分化來源OECs和嗅

2、上皮均來源于嗅基板，而嗅球與其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)均起源于神經(jīng) 管，因此在胚胎發(fā)育過程中嗅上皮與嗅球發(fā)育是兩種不同的方向， 原始嗅覺神經(jīng) 元伴隨大量基板細(xì)胞從嗅上皮傳出軸突向端腦泡方向遷移， 其中嗅鞘細(xì)胞引導(dǎo)嗅 神經(jīng)軸突到達(dá)端腦泡， 這些細(xì)胞形成早期的嗅球， 接著嗅球發(fā)生外翻， 遷移細(xì)胞 覆在其表面形成一薄層， 接著它們穿透膠質(zhì)界膜引導(dǎo)形成嗅神經(jīng)層和小球?qū)樱?成 為覆蓋在嗅球表面新的膠質(zhì)界膜， 不同于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它組織的是： 在成人 階段嗅鞘細(xì)胞依然可穿過這種膠質(zhì)界膜。主要特性嗅鞘細(xì)胞是一種嗅神經(jīng)的支持細(xì)胞， 它包被神經(jīng)軸突遷徙入腦， 在顱底它和嗅球 的僧帽細(xì)胞相結(jié)合。 分布于嗅神經(jīng)的全長，

3、 從嗅上皮基底膜一直到嗅球， 主要位 于嗅神經(jīng)的纖維層， 至于是否深入到顆粒層仍存在爭議。 嗅鞘細(xì)胞具有雪旺氏細(xì) 胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的特性， 但總的表現(xiàn)更趨于前者， 它有兩個(gè)獨(dú)特的特征。 第一， 它不僅存在于外周神經(jīng)（雪旺氏細(xì)胞） ，而且存在于中樞神經(jīng)（星形膠質(zhì)細(xì)胞） 第二，嗅粘膜具有終生再生能力， 包括人類的嗅鞘細(xì)胞， 這種再生是嗅鞘細(xì)胞參 與高效調(diào)控的過程， 盡管現(xiàn)在不清楚具體的機(jī)制。 嗅鞘細(xì)胞不同于星形細(xì)胞和雪 旺氏細(xì)胞， 但同時(shí)兼有這兩種細(xì)胞的特性， 有象雪旺氏細(xì)胞有助于軸突生長的作 用，但比雪旺氏細(xì)胞更能使軸突長距離生長， 即具有更強(qiáng)的遷徙性； 也有象星形 膠質(zhì)細(xì)胞一樣對神經(jīng)元的存活及

4、軸突的生長具有營養(yǎng)作用， 但嗅鞘細(xì)胞還能夠包 裹神經(jīng)元形成髓鞘， 支持神經(jīng)突起的生長。 正是這兩種特性使得嗅鞘細(xì)胞成為神 經(jīng)修復(fù)的最佳選擇。已發(fā)表的 53 篇關(guān)于嗅鞘細(xì)胞移植的文章，也強(qiáng)有力的證明 了嗅鞘細(xì)胞是神經(jīng)修復(fù)的最佳材料?？伤苄孕崆始?xì)胞被認(rèn)為是一種可塑性很高的細(xì)胞， 它可表現(xiàn)出多種細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面 標(biāo)志，在嗅系統(tǒng)發(fā)育過程中， 嗅鞘細(xì)胞根據(jù)其在組織定位的不同而有不同的抗原 表型，其中P75NTR、GFAP、和04可標(biāo)記大部分在體嗅鞘細(xì)胞，然而在嗅球外 神經(jīng)層 O4 陽性嗅鞘細(xì)胞仍然可以在 P75NTR 陽性細(xì)胞層內(nèi)分化成 E-NCAM 陽 性的細(xì)胞層，還有一定比率的嗅鞘細(xì)胞 P75NT

5、R 陰性而 NY 和 S100 表型為陽性。體內(nèi)嗅鞘細(xì)胞抗原表型的可塑性決定了其在體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)和抗原表型的可塑 性，已有研究證實(shí)純化的嗅鞘細(xì)胞能夠分化成兩種不同形態(tài)及不同表面標(biāo)記的細(xì) 胞，即星型膠質(zhì)細(xì)胞樣嗅鞘細(xì)胞和施萬細(xì)胞樣嗅鞘細(xì)胞。 星型膠質(zhì)細(xì)胞樣嗅鞘細(xì) 胞為扁平狀，表達(dá)高水平 E-NCAM 和 GFAP 而 P75NTR 陰性；施萬細(xì)胞樣嗅鞘 細(xì)胞表達(dá)P75NTR，部分為GFAP陽性而E-NCAM陰性。這兩種細(xì)胞關(guān)系并未 完全清楚，但是可以肯定它們來源于相同譜系，并且兩著之間是相關(guān)的。細(xì)胞培養(yǎng)OECs的培養(yǎng)，由胚胎、新生期、成年大鼠和小鼠的嗅球取材均已見報(bào)道。供體 組織年齡的不同， 培養(yǎng)

6、細(xì)胞的性質(zhì)也有一定的差異。 成熟嗅球從外到內(nèi)可分為以 下幾層：嗅神經(jīng)層、小球?qū)印⑼鈪矊?、僧帽?xì)胞層、內(nèi)叢層、粒層、髓層和室管 膜層。嗅球成鞘膠質(zhì)細(xì)胞包繞嗅神經(jīng)元的軸突經(jīng)外周部分進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)， 終 止于嗅球的嗅神經(jīng)層和小球?qū)印?在手術(shù)顯微鏡下取嗅球的最外兩層做培養(yǎng)， 可以 得到含量較高的 OECs。 Burry 等也曾經(jīng)進(jìn)行過嗅球神經(jīng)元體外培養(yǎng)的研究，他 們采用機(jī)械方法解離嗅球， 但是經(jīng)過這種機(jī)械分散方法， 細(xì)胞破碎較多， 細(xì)胞活 性差。在體外神經(jīng)元培養(yǎng)過程中采用胰蛋白酶化學(xué)消化和機(jī)械消化， 并在顯微鏡 下密切觀察，可以避免消化不充分和過度，使細(xì)胞活性提高。細(xì)胞分離嗅鞘細(xì)胞分離有傳統(tǒng)分離法：

7、嗅球置于少量 ACSF （人工腦脊液）中（4C冰浴）， 在解剖顯微鏡下，將位于嗅球最外層的嗅神經(jīng)層、 嗅神經(jīng)及包被的腦膜輕輕剝下， 用ACSF洗2次，組織塊用0.125%胰酶（Sigma）37C消化20min，經(jīng)胰酶消化的 組織塊再移至完全培養(yǎng)液 （DMEM ：胎牛血清 =9：1 美國 GIBCO 公司 ）中，用滴 管輕輕吹打組織塊使之形成細(xì)胞懸液備用。分層消化法：整個(gè)嗅球置于 0.125% 胰酶中，37r消化15min （不時(shí)搖動），取出含有細(xì)胞的酶液，終止酶反應(yīng)。剩 余的嗅球再用酶消化， 重復(fù)以上操作 6 次，細(xì)胞懸液分別收集于 6支小試管內(nèi)備 用。直接擠壓法：嗅球置于少量 ACSF 中，

8、用眼科鑷子直接將嗅球撕爛、擠壓， 將剩余的片狀組織塊轉(zhuǎn)移至另一試管內(nèi)，用 ACSF 洗 2次，組織塊用 0.125%胰 酶（Sigma） 37r消化20min，經(jīng)胰酶消化的組織塊再移至完全培養(yǎng)液中，用滴 管輕輕吹打組織塊使之形成細(xì)胞懸液。OECs 對傳統(tǒng)分離方法一般分為兩大類，一類是酶消化法，另一類是利用 p75NGFR 有特異免疫性的特點(diǎn)，采用免疫抗體包被培養(yǎng)瓶方法、磁珠懸浮法和 流式細(xì)胞儀分離法將 OECs 分離。產(chǎn)量上，直接擠壓法最高，傳統(tǒng)分離法次之， 分層消化法最低。 傳統(tǒng)方法 （包括免疫抗體包被培養(yǎng)瓶方法、 磁珠懸浮法和流式 細(xì)胞儀分離法）分離過程復(fù)雜，操作時(shí)間長，需要特殊儀器及器械

9、，特別是含OECs豐富的嗅神經(jīng)層非常薄，即使在解剖顯微鏡下也無法與其它組織區(qū)別，嗅 神經(jīng)更是難于找到，分離效果很差。直接擠壓法特點(diǎn)是操作簡單易行，省時(shí)，不 需要特殊儀器設(shè)備， 且在獲得細(xì)胞的數(shù)量上略多于傳統(tǒng)分離法。 直接擠壓法優(yōu)于 傳統(tǒng)方法和分層消化法。為了加快OECs的增殖速度，提高產(chǎn)量可以在培養(yǎng)液中加入一些促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì)，如在培養(yǎng)液中加入適量的牛垂體提取物（BPE） 可使OECs增殖明顯加快，但因其它細(xì)胞增殖也加快，使其純度有所下降。應(yīng)用Arae純化OECs方法簡便、經(jīng)濟(jì)，OECs純度可達(dá)70%左右。時(shí)一步純化還可用Thy-1.1 抗體殺死成纖維細(xì)胞， 文獻(xiàn)報(bào)道純度可達(dá) 99%以上，其

10、缺點(diǎn)是方法復(fù)雜、 費(fèi)用昂貴。細(xì)胞純化純化細(xì)胞的方法較多，一般有差速貼壁，化學(xué)藥物法，梯度離心法，免疫親和吸 附法。以后者純化效果最好， 其純度可達(dá) 99%以上，是目前普遍采用的方法之一。但是此法步驟較為繁瑣，費(fèi)用高，同時(shí)細(xì)胞經(jīng)過反復(fù)清洗，活性下降，于是給下步培養(yǎng)帶來了一定的困難。主要影響純化的是成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng) 24-48h 加入阿糖胞苷，可以有效抑制和 殺滅進(jìn)入分裂期的成纖維細(xì)胞，但 OECs也受到一定程度的抑制。使用 BPE來 促進(jìn)OECs增殖，第8-16d得到生長狀態(tài)良好的 OECs,純度可達(dá)80%。OECs 細(xì)胞表面具有特異性的低親和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（LNGFR）,可以特異性的與LN

11、GFR 抗體結(jié)合，為免疫純化提供了基礎(chǔ)，免疫純化后純度可以提高到98%。為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞表達(dá)OECs表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）,在血管壁形成終足，以及參與形成膠質(zhì)界膜，此界膜大致勾勒出了嗅神經(jīng)軸突與嗅球顆粒層嗅小球的交界線，OECs在 免疫細(xì)胞化學(xué)超微結(jié)構(gòu)特征以及與軸突的功能聯(lián)系方面與星形膠質(zhì)細(xì)胞存在明 顯不同。 OECs 對神經(jīng)生長因子受體（ P75NGR） Laminin 細(xì)胞粘附分子 L1CAML1 ）和 Vimentin 有陽性免疫反應(yīng)。在體外， OECs 對微管相關(guān)蛋白 2MAP-2 ）為免疫反應(yīng)陰性， 而這些抗原是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物。 在電鏡水平，OECs

12、核呈鋸齒狀，染色質(zhì)分布不均，高電子密度的胞漿中有微絲散在分布而星 形膠質(zhì)細(xì)胞核呈卵圓形，胞漿電子密度低，中間絲成束分布在嗅覺傳導(dǎo)路上，OECs成束包裹嗅神經(jīng)軸突，引導(dǎo)它們穿過 PNS與CNS移行區(qū)和蛛網(wǎng)膜下腔, 進(jìn)入嗅球體外OECs與神經(jīng)元共同培養(yǎng)時(shí)，它可以包裹神經(jīng)元軸突形成髓鞘， 支 持神經(jīng)突起的生長； 而星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外對神經(jīng)元的存活和軸突的生長只有一 般的營養(yǎng)作用，不形成髓鞘樣結(jié)構(gòu)。 OECs不具有少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫學(xué)特征, 雖然它能表達(dá)O-2A （少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物），但缺乏其它相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá), 包括對Rip、抗半乳糖腦苷酯、HNK-1、CD-3等的表達(dá)。OECs有時(shí)被稱為嗅覺系

13、統(tǒng)的SCs，但兩者在細(xì)胞來源和免疫學(xué)特性上明顯不同SCs來源于神經(jīng)脊細(xì)胞，而OECs來源于嗅基板兩者對 L1、P75NGR和A5E3均 呈陽性免疫反應(yīng)，不同的是，OECs表達(dá)中樞形式的GFAP, SCs不表達(dá)；OECs 不表達(dá)HNK-1和半乳糖腦苷酯，而SCs則均能表達(dá)。OECs可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、軸突生長刺激物質(zhì)，能促進(jìn)軸突的再生和髓鞘的形 成嗅覺系統(tǒng)的免疫組化和原位雜交研究提示 OECs 不僅可以分泌 BDNF、 NGF 神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 (neuortrophinfactor3, NT-3)和 NT-4，還能表達(dá) Laminin、L1、 纖粘連蛋白，S100、膠質(zhì)源性連接素(Glial-

14、derivednexin)和神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(N-CAM )所有這些因子均能支持軸突的延伸。研究歷史 從第一次嗅鞘細(xì)胞的生物學(xué)文章發(fā)表已經(jīng)有二十余年歷史了。 1994 年RamonCueto和Nieto-Sampedrol發(fā)表了第一篇關(guān)于嗅鞘細(xì)胞有助于感覺軸突長入 脊神經(jīng)切斷術(shù)的文章，在此之前 Doucette 實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了嗅鞘細(xì)胞移植人腦后存 活的文章，Raisman小組發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)脊髓束損傷后行嗅鞘細(xì)胞移植可以使神經(jīng)功能 恢復(fù)。從 1997年到現(xiàn)在的 9年里有 50篇文章是關(guān)于嗅鞘細(xì)胞移植的； 51 篇是 描述嗅鞘細(xì)胞生物學(xué)特征的，還有 31 篇是綜述性文章，而且大多是和神經(jīng)修復(fù) 有關(guān)。國內(nèi)黃

15、紅云教授率先開展了嗅鞘細(xì)胞的臨床試驗(yàn)， 并獲得了滿意的臨床效 果。嗅鞘細(xì)胞已逐漸引起了科學(xué)界的重視， 特別是在脊髓損傷修復(fù)領(lǐng)域， 被認(rèn)為 是治療脊髓損傷最具潛力的細(xì)胞。相關(guān)資料據(jù)美國物理學(xué)家組織網(wǎng)2010年11月15日報(bào)道，嗅鞘細(xì)胞(OECs)是包在嗅覺 神經(jīng)纖維外面起保護(hù)作用的被膜，過去 25年來，人們一直認(rèn)為嗅鞘細(xì)胞是由鼻 內(nèi)膜形成的，但英國科學(xué)家一項(xiàng)新研究顯示，嗅鞘細(xì)胞有著不同的起源。如果將嗅鞘細(xì)胞移植到受損的脊髓中， 能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)， 支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生， 這一新發(fā)現(xiàn)為治療脊髓損傷提供了更加可靠的資源。 該研究由英國維康基金和伊 薩克牛頓基金資助，研究結(jié)果發(fā)表在本周的美國國家科學(xué)院院

16、刊上。理論上講，可以利用病人鼻子中取出的內(nèi)膜組織， 在培養(yǎng)皿中生長出嗅鞘細(xì)胞來， 然后將其移植到損傷的脊髓中就能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)， 而無需擔(dān)心任何排異反應(yīng)。 但 這種方法得到的細(xì)胞數(shù)量太少，不能為治療提供足夠的來源。論文主要作者、英國劍橋大學(xué)發(fā)展與神經(jīng)科學(xué)生物系的克雷爾-貝克博士說：“鼻 內(nèi)膜中的嗅鞘細(xì)胞太少了， 其中還包裹著周邊神經(jīng)纖維， 而這些纖維和嗅鞘細(xì)胞 非常相似，對促進(jìn)脊髓修復(fù)沒什么效果。 很難從鼻內(nèi)膜中提純出足夠的嗅鞘細(xì)胞， 進(jìn)行有效的移植治療。 ”源自一種名為而這項(xiàng)新研究發(fā)現(xiàn)， 嗅鞘細(xì)胞和其他包裹著神經(jīng)纖維的細(xì)胞一樣， 神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells的胚胎干細(xì)胞。為找到嗅鞘細(xì)胞的起源，研究人 員用綠色熒光蛋白標(biāo)記了胚胎神經(jīng)嵴細(xì)胞，使其在紫外線照射下可發(fā)出綠色熒 光。利用基因技術(shù)， 研究人員在小雞和小鼠的胚胎