氨基酸的薄層層析實驗報告

1、生物化學實驗報告姓 名： XXXXX 學 號： XXXXXXXXXXXXXX 專業(yè)年級： XXXXXXXXXXXXXXX 組 別： 第X實驗室 生物化學與分子生物學實驗教學中心實驗名稱氨基酸的薄層層析實驗日期XXXX-XX-XX實驗地點第X實驗室合作者XXXX指導老師XXX評分 教師簽名 批改日期 一、實驗目的1、掌握薄層層析法的實驗原理。2、掌握氨基酸薄層層析法的基本操作方法。3、掌握如何根據(jù)移動速率（Rf值）來鑒定被分離的物質（即氨基酸混合液）的方法。二、實驗原理1、薄層層析法是色譜分析技術的一種。是將吸附劑、載體或其他活性物質均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、金屬片等）上，形成薄層（常

2、用厚度為0.25毫米左右）后，在此薄層上進行層析分離的分析方法。一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當液相（展開溶劑）在固定相上流動時，由于吸附劑對不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復進行，而將樣品各組分分離開來）硅膠吸附薄層層析：吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠。硅膠：表達式為SiO2·XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質，它的硅氧環(huán)交鏈結構表面上密布極性硅醇基（SiOH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附.硅

3、膠吸附薄層層析的特點： 硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負性相關。硅醇基顯較弱的酸性，因此，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。硅膠的活化溫度通常為105110，不能過高。2、氨基酸與茚三酮的顯色反應： 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它與氨基酸的羧基反應生成還原茚三酮、氨及醛，與此同時，還原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生成紫紅化合物而使氨基酸斑點顯色。3、混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對遷移率Rf值（rate of flow）來表示。層析中，物質沿溶劑運動方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值。即：=由于物質在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故

4、移動速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質。三、材料與方法：（一）、材料：分析樣品（氨基酸混合液）、吸附劑（硅膠）、粘合劑（0.5%的羧甲基纖維素鈉）、氨基酸的異丙醇溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸）、展開-顯色劑（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）；（二）、器材：層析板（5cm×15cm）、尺子、鉛筆、小燒杯、玻棒、量筒（10ml）、吹風機、毛細玻璃管、層析缸、藥匙、烘箱；（三）、方法：制版點樣層析顯色處理與結果分析1、實驗流程：2、操作步驟：調漿：稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調成均勻的糊狀。（1）薄層板的制備：涂布：取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。

5、 干燥：將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干?；罨?0烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時取出。 標記：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個點并做好標記。每個樣品間相距約1cm。（2）點樣：取樣：用毛細管分別吸取氨基酸溶液，取樣量為毛細管柱高5cm。 點樣：點樣毛細管輕輕接觸薄層表面點樣（輕觸疾起）。加樣后原點擴散直徑不超過2mm。 （將薄層板點樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應低于點樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。3）層析： 當展層劑前沿離薄層板頂端2cm時，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界限。（用熱風吹干或在90下烘干30分鐘，即可顯出各層斑點。4）顯色：四、結

6、果與討論： （一）結果：1、實驗數(shù)據(jù)：樣品各氨基酸色斑中心至樣品原點中心距離及溶劑前緣至樣品原點中心距離記錄丙氨酸甘氨酸精氨酸混合點1混合點2混合點3各氨基酸色斑中心至原點中心的距離a（cm）3.402.781.751.752.853.49溶劑前緣至樣品原點中心距離b（cm）6.676.676.676.676.676.67根據(jù)Rf=計算，得：樣品Rf值推斷的氨基酸名稱丙氨酸0.510-甘氨酸0.417-精氨酸0.262-混合點10.262精氨酸混合點20.427甘氨酸混合點30.523丙氨酸2、 現(xiàn)象：（1）點樣時，點擴散后大小適中，不超2mm。（2）層析時，浸入展層-顯色液時層析板放得比較正

7、，在層析約40min后溶劑前緣到超過達層析板的1/2處，取出并烘干。溶劑前沿是一條較平整的水平線。（3）在利用烤箱烘干后，層析板上出現(xiàn)6個的紫紅色斑點，混合點2顯色較淺。（4）第一次制備薄層板時，涂板非常不均勻；第二次制備的薄層板薄厚較為均勻。（二）結果討論：1、結果上的誤差問題：在實驗的結果中，我們可以發(fā)現(xiàn)混合點2的Rf=0.4270.417（測定的標準值），混合點3的Rf=0.5230.510（測定的標準值）。原因可能有：（1）在整個實驗過程中，層析板的制作是基礎，硅膠分布的均勻與否直接影響了實際的實驗。而從溶劑前沿并不完全水平可以知道，實驗所用的層析板質量不是很好，一定程度上影響了實驗的

8、數(shù)據(jù)測定，導致實驗的誤差。（2）人為誤差的存在，在判定斑點前沿和測量距離時，存在一定的誤差，導致了結果上的不一致性，但這類影響較小。2、結果反思：學習制作層析板的技巧，多做多練，在練好基礎技能的前提下，可以提高實驗的準確率和成功率。3、結論：薄層層析法操作較為簡單，在實驗的結果上也比較的精確，能有效地分離出樣品各組分。運用在本實驗，效果也較好。根據(jù)計算所得的數(shù)據(jù)，可見混合點1的Rf（0.262）值等于精氨酸的Rf值（0.262），混合點2的Rf值（0.427）接近于甘氨酸的Rf值（0.417），混合點3的Rf值（0.523）接近于丙氨酸的Rf值（0.510）。又由實驗原理可得，由于吸附劑對不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。所以每一