酶工程習(xí)題答案

1、 第一章 緒論一. 名詞解釋酶工程:酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過(guò)程。轉(zhuǎn)換數(shù)：每摩爾酶每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)，是酶催化效率的一個(gè)指標(biāo)。催化周期：轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)，即酶進(jìn)行一次催化所需時(shí)間，單位為毫秒或微秒。比活力：游離酶的比活力指每毫克酶蛋白或核酶RNA所具有的酶活力單位數(shù)，固定化酶的比活力指每克干固定化酶所具有的酶活力單位數(shù)。酶活力：指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，其衡量的標(biāo)準(zhǔn)是酶促反應(yīng)速度酶活力的國(guó)際單位：在特定條件下，每1min催化1mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。異構(gòu)酶：催化分子內(nèi)部基團(tuán)位置或構(gòu)象轉(zhuǎn)換的酶。變構(gòu)酶：活性受別構(gòu)調(diào)節(jié)物調(diào)控的酶。核酶：既可以催化酶分子本身也可以

2、催化其他分子進(jìn)行反應(yīng)的具有催化作用的RNA?？贵w酶：一類具有催化功能的抗體。競(jìng)爭(zhēng)性抑制：指抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)與酶分子結(jié)合而引起的抑制作用。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：在底物與酶分子結(jié)合生成中間復(fù)合物后，抑制劑再與中間復(fù)合物結(jié)合而引起的抑制作用。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：指抑制劑與底物分別與酶分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合而引起酶活性降低的抑制作用。酶結(jié)合效率：又稱酶的固定化率，指酶與載體結(jié)合的百分率。酶活力回收率：指固定化酶的總活力與用于固定化的總酶活力的百分率。固定化酶的相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或核酶）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值。二填空 1.催化； 2.絕對(duì)專一性、相對(duì)專一性、立體結(jié)構(gòu)專一性； 3.底物濃度、酶濃度、

3、溫度、PH、抑制劑、激活劑； 4.蛋白類酶、核酸類酶； 5.自我剪切酶、自我剪接酶； 6.RNA剪切酶、DNA剪切酶、多糖剪接酶、多肽剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能R酶； 7.震蕩測(cè)定法、酶柱測(cè)定法、連續(xù)測(cè)定法； 8.每克干固定化酶； 9.提取分離法、生物合成法、化學(xué)合成法。三判斷題 1. 分子間催化的R酶中有許多酶的底物并非RNA，例如DNA剪切酶的底物為DNA； 2. 它還可以作用于自身RNA; 3. 它可以有多種底物，如DNA、RNA、多糖等； 4. 酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)和RNA。四簡(jiǎn)答題1. 簡(jiǎn)述酶的研究簡(jiǎn)史。答案：人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)與生活實(shí)踐。夏禹時(shí)代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元

4、前12世紀(jì)周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。西方國(guó)家19世紀(jì)對(duì)釀酒發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了大量研究。直到1897年，德國(guó)巴克納Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母細(xì)胞，制備了不含酵母細(xì)胞的抽提液，并證明此不含細(xì)胞的酵母提取液也能使糖發(fā)酵，說(shuō)明發(fā)酵與細(xì)胞的活動(dòng)無(wú)關(guān)。從而說(shuō)明了發(fā)酵是酶作用的化學(xué)本質(zhì)，為此Buchner獲得了1911年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1896年,日本的高峰讓吉首先從米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化劑,開(kāi)創(chuàng)了有目的的進(jìn)行酶生產(chǎn)和應(yīng)用的先例。1878年, 給酶一個(gè)統(tǒng)一的名詞，叫Enzyme，這個(gè)字來(lái)自希臘文，其意思“在酵母中”。后來(lái)對(duì)酶的作用機(jī)理及酶的本質(zhì)做

5、了深入研究，1930年，證實(shí)酶是一種蛋白質(zhì)；80年代初發(fā)現(xiàn)了具有催化功能的RNA核酶(ribozyme)，這一發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，開(kāi)辟了酶學(xué)研究的新領(lǐng)域，現(xiàn)已鑒定出4000多種酶，數(shù)百種酶已得到結(jié)晶，而且每年都有新酶被發(fā)現(xiàn)。2. 簡(jiǎn)述酶工程的發(fā)展概況。答案：酶工程的發(fā)展包括四個(gè)階段:(1)酶的簡(jiǎn)單應(yīng)用。(2)固定化酶的應(yīng)用。(3)固定化酶系統(tǒng)和固定化活細(xì)胞技術(shù)聯(lián)合。(4)新的生物工程技術(shù)應(yīng)用于酶工程。3. 簡(jiǎn)要回答酶的催化特點(diǎn)。答案：（1）易失活。高溫、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、重金屬鹽可導(dǎo)致失活。（2）酶促反應(yīng)具有極高的效率。酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高1081020倍，比一般催化劑高107

6、1013倍。（3）酶促反應(yīng)具有高度的專一性。（4）酶活性可調(diào)節(jié)。（5）反應(yīng)條件溫和。常溫、常壓，中性pH環(huán)境。4. 簡(jiǎn)要回答影響酶催化作用的因素。答案：（1）底物濃度。（2）酶濃度。（3）溫度。（4）ph。（5）抑制劑。（6）激活劑。5. 簡(jiǎn)要回答米氏方程的意義。答案：1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式，簡(jiǎn)稱米氏方程式(Michaelis equation)。這一學(xué)說(shuō)的提出對(duì)酶反應(yīng)機(jī)制的研究是一個(gè)重要的突破。6. 簡(jiǎn)述酶工程的研究?jī)?nèi)容及主要任務(wù)。答案：酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的技術(shù)過(guò)程稱為酶工程，其主要內(nèi)容包括微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)

7、酶、酶的提取和分離純化、酶細(xì)胞原生質(zhì)的固定化、酶反應(yīng)器和酶的應(yīng)用、酶非水相催化、酶分子修飾、酶的定向進(jìn)化。7. 舉例說(shuō)明酶活力的測(cè)定在酶的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中的重要性。答案：酶活力是指在一定條件下，酶催化某一反應(yīng)的反應(yīng)速度（一般測(cè)初速度）。 酶促反應(yīng)速度是指單位時(shí)間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。單位：濃度/單位時(shí)間酶的活力單位（U） 國(guó)際單位（IU單位）：在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1umol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱一個(gè)國(guó)際單位（IU），1 IU = 1umol /min 國(guó)際單位（Katal, Kat單位）： 在最適反應(yīng)條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱K

8、at單位。1 Kat=60 X 106 IU酶活力的測(cè)定方法：分光光度法；熒光法；同位素法；電化學(xué)法。 8試述酶工程的發(fā)展概況與前景。答案：1908年,德國(guó)的羅姆制得胰酶,用于皮革的軟化。1908年,法國(guó)的波伊登(Boidin)制備了細(xì)菌淀粉酶,應(yīng)用于紡織品的退漿。1911年,美國(guó)的華勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁。此后,酶的生產(chǎn)和應(yīng)用逐步發(fā)展。然而在50年代以前停留在從微生物，動(dòng)物或植物中提取酶,加以利用階段.由于當(dāng)時(shí)生產(chǎn)力落后,生產(chǎn)工藝較繁雜,難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。1949年,用液體深層培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)菌淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn),揭開(kāi)了近代酶工業(yè)的序幕。5

9、0年代以后,隨著生化工程的發(fā)展,大多數(shù)酶制劑的生產(chǎn)已轉(zhuǎn)向微生物流體深層發(fā)酵的方法。酶的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。1953年德國(guó)科學(xué)家首先將聚氨基苯乙烯樹(shù)脂與淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等結(jié)合,制成了固定化酶。60年代，是固定化酶技術(shù)迅速發(fā)展的時(shí)期。1969年,日本的千煙一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。出現(xiàn)了“酶工程”這個(gè)名詞來(lái)代表有效利用酶的科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。1971年第一屆國(guó)際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議在美國(guó)召開(kāi),當(dāng)時(shí)的主題即是固定化酶，進(jìn)一步開(kāi)展了對(duì)微生物細(xì)胞固定化的研究。1973年,千煙一郎首次利用固定化的大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)L-天冬氨酸。1978年,日本的鈴木等固定化細(xì)胞生

10、產(chǎn)-淀粉酶研究成功。70年代是固定化細(xì)胞技術(shù)取得進(jìn)展的時(shí)期.80年代，固定化細(xì)胞已能用于生產(chǎn)胞外酶。在酶的固定化技術(shù)發(fā)展的同時(shí),酶分子修飾技術(shù)也取得了進(jìn)展。60年代，用小分子化合物修飾酶分子側(cè)鏈基團(tuán),使酶性質(zhì)發(fā)生改變;70年代,修飾劑的選用、修飾方法上又有了新的發(fā)展。此外,對(duì)抗體酶,人工酶,模擬酶等方面,以及酶的應(yīng)用技術(shù)研究,在近20年均取得了較大進(jìn)展,使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展,顯示出廣闊而誘人的前景。9. Payen和Person、Buchner兄弟、Sumner、Fisher、Koshland、Henri、Michaelis和Menten、Jacob和Monod、Cech和Altmam

11、及千佃一郎對(duì)酶學(xué)的主要貢獻(xiàn)是什么？答案：1833年，Payen和Person從麥芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一種對(duì)熱不穩(wěn)定的活性物質(zhì)，它可促進(jìn)淀粉水解成可溶性糖。他們把這種物質(zhì)稱為淀粉酶制劑。 1896年，德國(guó)學(xué)者Buchner兄弟用酵母提取液實(shí)現(xiàn)發(fā)酵，證明發(fā)酵過(guò)程并不需要完整細(xì)胞，而是可以離開(kāi)細(xì)胞的生命活動(dòng)而存在。他把這種能發(fā)酵的蛋白質(zhì)成分稱為酒化酶(eymase)。一般認(rèn)為酶學(xué)研究始于Buchner的這一發(fā)現(xiàn)。此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了酶的分離和對(duì)其理化性質(zhì)的探討，也促進(jìn)了對(duì)有關(guān)各種活動(dòng)中酶系統(tǒng)的研究。 1926年，Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶，提出酶本身就是一種蛋白質(zhì)。 1894年Fischer

12、提出酶發(fā)生作用的“鎖和鑰匙”的模型。 20世紀(jì)5060年代，Koshland提出“誘導(dǎo)契合”理論，以解釋酶的催化理論和專一性。 1902年，Henri提出中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)。 1913年，Michaelis和Menton提出酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理米氏方程。這一學(xué)說(shuō)的提出對(duì)酶反應(yīng)機(jī)制的研究是一個(gè)重要的突破。 1960年，Jacob 和 Monod提出操縱子學(xué)說(shuō)。 1982年，Thomas R.Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)細(xì)胞的26S rRNA前體具有自我剪接功能，將這種具有催化活性的天然RNA稱為核酶Ribozyme。1983年，Altman等人發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶P的RNA組分具有加工tRNA前體的催化功能。而RN

13、ase P中的蛋白組分沒(méi)有催化功能，只是起穩(wěn)定構(gòu)象的作用。1969年，日本千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨基?；腹潭ㄔ贒EAE-葡萄糖凝膠上從DL-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。 第二章 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶一、 名詞解釋誘導(dǎo)物：能夠引起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)。誘導(dǎo)作用：加入某些物質(zhì)使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象。終產(chǎn)物阻遏：催化某一特異產(chǎn)物合成的酶，在培養(yǎng)基中有該產(chǎn)物存在的情況下常常是不合成的，即受阻遏的。這種由于終產(chǎn)物的過(guò)量積累而導(dǎo)致的生物合成途徑中酶合成的阻遏稱為終產(chǎn)物阻遏。分解代謝產(chǎn)物阻遏：指某些物質(zhì)（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）經(jīng)過(guò)分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)

14、象。葡萄糖效應(yīng)：在有葡萄糖存在的情況下，優(yōu)先利用葡萄糖生長(zhǎng)，待葡萄糖耗盡后，再利用另一種底物生長(zhǎng)。 組成型酶：在細(xì)胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對(duì)其合成速率影響不大的一類酶。適應(yīng)型酶：在細(xì)胞中的含量變化很大，合成速率明顯受環(huán)境因素影響的一類酶。 結(jié)構(gòu)基因：是決定合成某一種蛋白質(zhì)或RNA分子結(jié)構(gòu)相應(yīng)的一段DNA。把攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)錄給mRNA,再以mRNA為模板合成具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)或RNA。啟動(dòng)子：DNA分子上能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域。 操縱子：由啟動(dòng)基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因一起組成的一個(gè)轉(zhuǎn)錄功能單位。操縱基因：位于結(jié)構(gòu)基因的一端，是操縱結(jié)構(gòu)基因的基因。調(diào)節(jié)基因

15、：是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的基因。它能使結(jié)構(gòu)基因在需要某種酶時(shí)就合成某種酶,不需要時(shí),則停止合成，它對(duì)染色體上的結(jié)構(gòu)基因有調(diào)節(jié)作用。 固定化細(xì)胞：是指固定在水不溶性載體上，在一定的空間范圍進(jìn)行生命活動(dòng)（生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝等）的細(xì)胞。原生質(zhì)體：脫去細(xì)胞壁的細(xì)胞叫原生質(zhì)體。CAP：指分解代謝物活化蛋白。在分解代謝阻遏中調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是降解物基因活化蛋白（CAP），它能與 環(huán)腺苷酸（cAMP）結(jié)合而被活化，幫助RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。胞內(nèi)酶：在細(xì)胞內(nèi)起催化作用的酶，這些酶在細(xì)胞內(nèi)常與顆粒體結(jié)合并有著一定的分布。胞外酶：細(xì)胞內(nèi)合成而在細(xì)胞外起作用的酶，包括位于細(xì)胞外表面或細(xì)胞外空間的酶。二、

16、填空 1. 微生物細(xì)胞中對(duì)酶的生物合成最重要的調(diào)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，主要調(diào)節(jié)方式有分解代謝物阻遏作用、酶合成的誘導(dǎo)作用、酶合成的反饋?zhàn)瓒糇饔谩?. 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與酶生物合成的關(guān)系，酶生物合成的模式可分為同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型 。其中 同步合成型和延續(xù)合成型的酶合成可以受誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)，而中期合成型和滯后合成型的酶合成受阻遏，同步合成型和中期合成型的酶所對(duì)應(yīng)的mRNA 穩(wěn)定性較差；而延續(xù)合成型和滯后合成型的酶所對(duì)應(yīng)的mRNA 穩(wěn)定性好。3. 產(chǎn)酶微生物具有酶的產(chǎn)量高、容易培養(yǎng)和管理、產(chǎn)酶穩(wěn)定性好、利于酶的分離純化、安全可靠，無(wú)毒性特點(diǎn)。4. 細(xì)胞生長(zhǎng)的莫諾德動(dòng)力學(xué)模型為 =

17、dX/dt1/X=mS/Ks+S ，其中Ks代表 莫諾德常數(shù) ，是指 比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。m為 最大比生長(zhǎng)速率，是指 限制性底物濃度過(guò)量時(shí)的比生長(zhǎng)速率。5. 酶發(fā)酵生產(chǎn)的前提之一，是根據(jù)產(chǎn)酶的需要，選育得到性能優(yōu)良的微生物。一般說(shuō)來(lái)，優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物應(yīng)當(dāng)具備的條件酶的產(chǎn)量高、容易培養(yǎng)和管理、產(chǎn)酶穩(wěn)定性好、利于酶的分離純化、安全可靠，無(wú)毒性.6. 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與酶產(chǎn)生的關(guān)系可把酶生物合成的模式分4種類型：同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型，其中理想模式應(yīng)是延續(xù)合成型。三、判斷 1. 同步合成型的酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)是同步進(jìn)行的。 2. 延續(xù)合成型的酶

18、的生物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)到達(dá)平衡期后開(kāi)始。錯(cuò)（延續(xù)合成型的酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，進(jìn)入平衡期后還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。） 3. 滯后合成型的酶的生物合成是在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或進(jìn)入平衡期以后才大量開(kāi)始。 4. 中期合成型的酶的生物合成是在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始。錯(cuò)（中期合成型的酶在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，平衡期以后停止。） 5. 同步合成型的酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很穩(wěn)定。錯(cuò)（同步合成型的酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。） 6. 色氨酸操縱子對(duì)酶生物合成的調(diào)節(jié)屬于反饋?zhàn)瓒糇饔?。四、?jiǎn)答1.舉例說(shuō)明酶生物合成調(diào)節(jié)作用機(jī)制在產(chǎn)酶微生物菌種改造中的指導(dǎo)意義。答：酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔茫豪?/p>

19、色氨酸操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制。在沒(méi)有阻遏物存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因(R)產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因(O)的親和力弱，不能與操縱基因結(jié)合，所以RNA聚合酶可以結(jié)合到其在啟動(dòng)基因的結(jié)合位點(diǎn)上，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而合成結(jié)構(gòu)基因（S）所對(duì)應(yīng)的酶。 當(dāng)環(huán)境中色氨酸濃度增加，阻遏物達(dá)到一定濃度時(shí)，阻遏蛋白與阻遏物結(jié)合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使阻遏蛋白與操縱基因的結(jié)合能力增強(qiáng)。阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，就排擠RNA聚合酶與啟動(dòng)基因的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)行，酶的生物合成因此受到阻遏。2舉例說(shuō)明酶生物合成調(diào)節(jié)作用機(jī)制在酶發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化中的指導(dǎo)意義。答：（1）：酶生物合成調(diào)節(jié)的方式：誘導(dǎo)和阻遏。（2）：誘導(dǎo)：誘導(dǎo)酶是由誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的。所以可

20、以多加些誘導(dǎo)物來(lái)誘導(dǎo)酶的合成。但是在實(shí)踐中，為了能夠大量生產(chǎn)各種誘導(dǎo)酶，需要用突變作用來(lái)消除微生物酶的合成須依賴外來(lái)的誘導(dǎo)物這種天生的障礙。例如：在誘導(dǎo)物為限制性機(jī)制的恒化器中篩選大腸桿菌在低乳糖濃度的恒化器中生長(zhǎng)，就可以篩選出能在無(wú)誘導(dǎo)物存在的條件下形成半乳糖苷酶。（3）：阻遏：末端產(chǎn)物阻遏：代謝途徑中末端代謝產(chǎn)物過(guò)量積累而引起的阻遏。例如：谷氨酸棒桿菌在生產(chǎn)谷氨酸時(shí)會(huì)因?yàn)楣劝彼岬倪^(guò)量積累而抑制谷氨酸的產(chǎn)生，所以可以增加菌的細(xì)胞膜透性是合成的谷氨酸迅速分泌到胞外。：分解代謝物阻遏：葡萄糖效應(yīng) 例如：大腸桿菌會(huì)在葡萄糖用盡的情況下才啟動(dòng)利用乳糖的相關(guān)的酶的合成，所以在培養(yǎng)基中不應(yīng)該添加葡萄糖，

21、只添加乳糖。3. 簡(jiǎn)要回答酶的催化特點(diǎn)。答：（1）酶催化的高效性；（2）酶催化的高度專一性；(3) 酶催化的反應(yīng)條件溫和；（4）酶活性的可調(diào)控性；（5）結(jié)合酶催化的活性與輔酶、輔基和金屬離子有關(guān)。4 簡(jiǎn)要回答對(duì)微生物產(chǎn)酶菌種的要求？答：（1）酶的產(chǎn)量高 （2）容易培養(yǎng)和管理 （3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 （4）利于酶的分離純化 （5）安全可靠，無(wú)毒性5.如果要篩選酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株，請(qǐng)制定篩選計(jì)劃。答:篩選計(jì)劃如下：（1）采樣 從肉類加工廠附近和飯店排污水污泥中分離得到蛋白酶的產(chǎn)生菌（2）富集培養(yǎng) 改變培養(yǎng)基的PH值到2.04.0進(jìn)行培養(yǎng)使目的菌相對(duì)數(shù)量加速增加（3）分離培養(yǎng) 在產(chǎn)生菌的分離平板中加入適

22、量的奶粉能產(chǎn)生蛋白酶的菌株就可以因?yàn)榈鞍酌阜纸饽谭鄣牡鞍踪|(zhì)使其周圍形成透明圈而被分離出來(lái)（4）目的微生物的篩選 挑取單菌落涂布鏡檢形態(tài)特征,挑選高純度的菌株穿刺低溫保藏 6.結(jié)合酶生物合成模式，淺談如何提高酶的生物合成量?答：酶的生物合成模式有4種，同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型，滯后合成型。 同步合成型的酶可以由其誘導(dǎo)物誘導(dǎo)生成，可在進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期時(shí)，添加適宜誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶產(chǎn)量。還要盡量提高其對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，為此適當(dāng)降低發(fā)酵溫度也是可采取的措施。 延續(xù)合成型的酶受誘導(dǎo)物誘導(dǎo)，不受分解代謝物阻遏，可以在細(xì)胞生長(zhǎng)平衡期，加入適宜誘導(dǎo)物。 中期合成型的酶受到產(chǎn)物的反饋抑制作用或

23、分解代謝物阻遏，通過(guò)控制阻遏物的濃度，可以提高酶產(chǎn)量。為了減少或解除代謝物阻遏的酶，應(yīng)當(dāng)降低培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度，可以采用其他較難利用地碳源如淀粉，控制碳源的濃度在較低水平。對(duì)于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過(guò)控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。 滯后合成型的酶要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝阻遏作用，是酶的生物合成提早開(kāi)始。 另外，添加表面活性劑和產(chǎn)酶促進(jìn)劑也可提高某些酶的產(chǎn)量。7. 黑曲霉可由果膠誘導(dǎo)合成聚半乳糖醛酸酶，葡萄糖的大量存在阻遏聚半乳糖醛酸酶的合成。當(dāng)以純果膠為誘導(dǎo)物時(shí)，該酶的生物合成模式為哪種類型？若以含有葡萄糖的粗果膠為

24、誘導(dǎo)物時(shí)，該酶又成為哪種合成模式？為什么？答：當(dāng)以純果膠為誘導(dǎo)物時(shí)，培養(yǎng)一段時(shí)間以后（約40小時(shí)），細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入旺盛時(shí)期，此時(shí)，聚半乳糖醛酸酶開(kāi)始合成；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平衡期（約80小時(shí)）后，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平衡，然而該酶卻繼續(xù)合成，直至120小時(shí)以后，呈現(xiàn)延續(xù)合成型的生物合成模式。若以含有葡萄糖的粗果膠為誘導(dǎo)物時(shí)，細(xì)胞濃度在20小時(shí)達(dá)到高峰，但是聚半乳糖醛酸酶的生物合成由于受到分解代謝物阻遏作用而推遲合成的時(shí)間，直到葡萄糖被細(xì)胞利用完之后，酶才開(kāi)始合成，呈現(xiàn)出滯后合成型的合成模式。8、 根據(jù)你所學(xué)的知識(shí)，闡述酶合成的理論基礎(chǔ)以及酶的發(fā)展前景。答：酶合成的理論基礎(chǔ)：轉(zhuǎn)錄和翻譯。構(gòu)建有別于天然功能酶的

25、新酶類，例如：催化抗體（Catalyticantibody）并稱抗體酶（Abzyme）是人們賦予其催化功能的免疫球蛋白，抗體是目前最大的多樣性家族，與抗原有結(jié)合部位與酶相似，但無(wú)催化活性。酶促催化在于與底物結(jié)合產(chǎn)生過(guò)渡態(tài)，降低能障。人工合成酶（Synzyme）是合成具有催化功能的高聚物分子，目前使用分子印跡和生物印跡技術(shù)制備人工酶，原理與抗體酶過(guò)渡態(tài)理論大致相同，已經(jīng)初步制備了具有蛋白酶功能，氧化還原酶催化功能的人工酶，人工酶亦可用于手性藥物及化合物的分離純化及生物傳感器的分子識(shí)別，目前人工酶的催化轉(zhuǎn)換數(shù)仍很低，需要多學(xué)科配合，對(duì)酶催化分子機(jī)理的深入了解，才會(huì)有可能在特殊反應(yīng)中優(yōu)于天然酶。9、

26、比較細(xì)胞生長(zhǎng)與酶產(chǎn)生的關(guān)系可將酶生物合成分為幾種類型模式，簡(jiǎn)述其特點(diǎn)。說(shuō)明在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中最理想的合成模式。答：（1）酶生物合成的模式可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與酶產(chǎn)生的關(guān)系分為4種類型：同步合成型(生長(zhǎng)偶聯(lián)型)、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型（非生長(zhǎng)偶聯(lián)型）。（2）其中理想模式應(yīng)是延續(xù)合成型。延續(xù)合成型的酶其生物合成可受誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物阻遏；該類酶在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平衡期以后，仍然可以延續(xù)合成，酶所對(duì)應(yīng)的mRNA相對(duì)穩(wěn)定。10、酶發(fā)酵生產(chǎn)的前提之一，是根據(jù)產(chǎn)酶的需要，選育得到性能優(yōu)良的微生物。說(shuō)明優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物應(yīng)當(dāng)具備的條件。答：優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物應(yīng)當(dāng)具備的條件酶的產(chǎn)量高；穩(wěn)定性好；易培

27、養(yǎng)；利于分離純化；安全無(wú)毒。11、簡(jiǎn)述轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程。 答：（一）轉(zhuǎn)錄包括4個(gè)步驟：(1)轉(zhuǎn)錄的起始：全酶的形成酶與模版結(jié)合酶與啟動(dòng)基因結(jié)合模版DNA局部變性轉(zhuǎn)錄開(kāi)始(2)RNA鏈的延伸:全酶釋放因子，成為核心酶，核心酶沿DNA模版移動(dòng)生成多聚核苷酸鏈，再逐漸形成雙螺旋。(3)RNA鏈的終止：當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄到終止子時(shí)，合成終止。(4)RNA前體的加工：包括一系列的催化反應(yīng)，這些酶反應(yīng)主要包括剪切反應(yīng)，剪接反應(yīng)，末端連接反應(yīng)，核苷酸修飾反應(yīng)等。 （二）翻譯包括5個(gè)步驟：（1）氨基酸活化生成氨酰-tRNA:氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的催化作用下，由ATP提供能量，與特定的tRNA結(jié)合生成氨酰

28、tRNA.（2）肽鏈合成的起始：在GTP和起始因子的參與下，核糖體30S亞基，fMET-tRNA,mRNA和50S亞基結(jié)合，組成起始復(fù)合物。（3）肽鏈的延伸： 啟始復(fù)合物形成后，fmet-tRNA便結(jié)合到P位，tRNA反密碼子與mRNA上的密碼子AUG識(shí)別配對(duì)。 在延伸因子EF1、EF2等的作用下，第二個(gè)AA-tRNA與mRNA第二個(gè)密碼子配對(duì)，并處在A位點(diǎn)。 在肽基轉(zhuǎn)移酶的作用下，P位的甲硫氨酸的羧基與A位上第二個(gè)氨基酸的氨基形成肽鍵，附著在A位的tRNA上。 P位上的tRNA離開(kāi)核糖體，核糖體沿著mRNA的3端移動(dòng)，結(jié)果是A位上的tRNA移動(dòng)到空出來(lái)的P位。 mRNA第三個(gè)密碼子暴露A位，

29、讓第三個(gè)AA-tRNA進(jìn)入。不斷重復(fù)這一過(guò)程，直到終止密碼出現(xiàn)，多肽鏈的合成便告結(jié)束。（4）肽鏈合成的終止：釋放因子進(jìn)入核糖體A位，合成的肽鏈被釋放出來(lái)。核糖體解離。（5）蛋白質(zhì)前體的加工：主要包括N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸的切除，二硫鍵的形成，肽鏈的剪切，氨基酸側(cè)鏈修飾，肽鏈的折疊和亞基的聚合等。12、用操縱子模型解釋酶的誘導(dǎo)與阻遏機(jī)制（末端產(chǎn)物、分解代謝產(chǎn)物）答案：（1）酶的誘導(dǎo)：當(dāng)無(wú)誘導(dǎo)物存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏物與操縱基因結(jié)合，阻止了RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，因而結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，由于誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合，從而改變了阻遏蛋白的構(gòu)型，使之不能與操縱基因結(jié)合，則RNA聚合酶可

30、以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)。（2）反饋?zhàn)瓒簦寒?dāng)無(wú)阻遏物時(shí)存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，因此，RNA聚合酶可以與啟動(dòng)基因結(jié)合，從而使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)合成對(duì)應(yīng)的酶；當(dāng)阻遏物達(dá)到一定濃度時(shí)，阻遏蛋白與阻遏物結(jié)合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)行，酶的合成受到阻遏。（3）分解代謝物阻遏：由于某些物質(zhì)經(jīng)過(guò)分解代謝放出能量，有一部分儲(chǔ)存在ATP中，ATP是由AMP和ADP通過(guò)磷酸化生成的。因此，細(xì)胞中ATP濃度增加時(shí)，AMP濃度降低。存在于細(xì)胞中的cAMP水解生成AMP。同時(shí)，腺苷酸環(huán)化酶的活化受到抑制而使cAMP的生成受阻，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低，

31、則cAMPCRP的復(fù)合物的濃度就隨之降低，使得啟動(dòng)基因上沒(méi)有足夠的cAMPCRP的復(fù)合物結(jié)合，RNA聚合酶也無(wú)法結(jié)合到啟動(dòng)基因的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)行，酶的生物合成受到阻遏。反之，ATP濃度降低，細(xì)胞內(nèi)ADP、AMP、cAMP的濃度增加 ，cAMPCRP的復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)基因的特定位點(diǎn)上，RNA聚合酶也結(jié)合到啟動(dòng)基因的相應(yīng)位點(diǎn)上，酶的生物合成進(jìn)行。13、優(yōu)良產(chǎn)酶微生物菌種的獲得途徑及各自特點(diǎn)。答：現(xiàn)大多數(shù)的酶都采用微生物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)酶微生物包括細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母等。優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)從富含該酶作用底物的場(chǎng)所采集樣品,也可從菌種保藏機(jī)構(gòu)有關(guān)研究部門(mén)獲得。第三章 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、名詞

32、解釋：1、操縱子：在原核生物中，很多功能上相關(guān)的基因排列成串，由一個(gè)共同的控制區(qū)轉(zhuǎn)錄，包括結(jié)構(gòu)基因、控制區(qū)以及調(diào)節(jié)基因的整個(gè)核苷酸序列叫做操縱子。操縱基因:是操縱子上位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。2、誘導(dǎo)酶：在正常細(xì)胞中沒(méi)有或只有很少量存在，但當(dāng)環(huán)境中有誘導(dǎo)物（一般是反應(yīng)的底物）存在時(shí)，微生物細(xì)胞會(huì)因誘導(dǎo)物存在而產(chǎn)生的酶就是誘導(dǎo)酶，誘導(dǎo)酶的合成除取決于環(huán)境中誘導(dǎo)物外，還受基因控制。組成酶是微生物細(xì)胞內(nèi)一直存在的酶，它的合成僅受遺傳物質(zhì)控制。3、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利

33、用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。4、外植體：從植株取出，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等）的片段或小塊。愈傷組織：將外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25左右培養(yǎng)一段時(shí)間，從外植體的切口部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。5、初篩：是指選育產(chǎn)酶菌種時(shí)對(duì)菌種的第一次分離篩選，以獲得一定數(shù)目的菌種為主要目的。復(fù)篩：是指選育產(chǎn)酶菌種時(shí)對(duì)菌種的第二次分離篩選，選出產(chǎn)酶水平相對(duì)較高的菌株，以質(zhì)為主。6、端粒：真核生物線性染色體的末端結(jié)構(gòu)，為一特

34、定的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)。其DNA序列由對(duì)生物特異的簡(jiǎn)單的串聯(lián)重復(fù)單位組成，能抵消每一輪DNA復(fù)制中因染色體降解而造成的關(guān)鍵功能碼序列的丟失。端粒酶：一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，RNA組分中含有一段短的模板序列與端粒DNA的重復(fù)序列互補(bǔ)，而其蛋白質(zhì)組分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA的合成，將其加到端粒的3端，以維持端粒長(zhǎng)度及功能。7、抗體酶：又稱催化性抗體，是一類具有生物催化功能的抗體分子。8、SOD：超氧化物歧化酶，能夠催化O2-和氫離子反應(yīng)形成過(guò)氧化氫和分子氧的酶，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，具有抗衰老的活性。二、簡(jiǎn)答：1、答：三者

35、的不同點(diǎn)見(jiàn)下表：微生物植物動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)有細(xì)胞壁，細(xì)胞體積小有細(xì)胞壁，細(xì)胞體積大無(wú)細(xì)胞壁，細(xì)胞體積較大培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，需要6大營(yíng)養(yǎng)要素，常用的培養(yǎng)基有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基成分相對(duì)動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單，在培養(yǎng)基中需要加入大量無(wú)機(jī)鹽，還需要加生長(zhǎng)激素、維生素等。使用的氮源為無(wú)機(jī)氮源。常用的培養(yǎng)基有MS,B5,N6培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)基中需要加入各種必需氨基酸，生長(zhǎng)因子，激素等。使用的培養(yǎng)基含血清的培養(yǎng)基或人工合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)方式微生物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)主用使用懸浮培養(yǎng)。植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)主要也是懸浮培養(yǎng)，但由于植物細(xì)胞對(duì)剪切力較敏感，因此培養(yǎng)時(shí)通風(fēng)和攪拌不應(yīng)強(qiáng)烈。并且植物細(xì)胞培養(yǎng)要求一定

36、的光照。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞由于錨地依賴性，所以不適宜懸浮培養(yǎng)。但近年來(lái)由于多孔載體的出現(xiàn)，使得動(dòng)物細(xì)胞也可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，適合大規(guī)模生產(chǎn)。2、答：酶合成的模式主要有以下四種：（1）同步合成型。同步合成型是酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式，又稱生長(zhǎng)偶聯(lián)型。屬于這一類型的酶，其生物合成伴隨細(xì)胞的生長(zhǎng)而開(kāi)始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期時(shí)，酶大量合成；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期時(shí)，酶的合成隨著停止。（2）延續(xù)合成型。延續(xù)合成型是酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間的一種酶生物合成模式。（3）中期合成型。中期合成型酶在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，而

37、在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。（4）滯后合成型。滯后合成型酶是在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始其生物合成并大量積累，又稱為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型。在四種模式中，延續(xù)合成型酶的合成可受誘導(dǎo)而又一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏，其所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定，是生產(chǎn)中最理想的合成模式。3、答：動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)主要有以下四種：（1）細(xì)胞分化改變酶的生物合成，這主要與基因表達(dá)的時(shí)間和空間特異性造成的。（2）基因擴(kuò)增加速酶的生物合成。通過(guò)基因擴(kuò)增來(lái)調(diào)節(jié)酶的生物合成可以在某些特殊條件下發(fā)生，作為應(yīng)急手段使某種酶的合成大量增加。（3）增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成。增強(qiáng)子是一段能高效增強(qiáng)或促

38、進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，在酶的生物合成過(guò)程中，可以高效增強(qiáng)某些酶基因的表達(dá)。（4）抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成。4、答：端粒酶是一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，RNA組分中含有一段短的模板序列與端粒DNA的重復(fù)序列互補(bǔ)，而其蛋白質(zhì)組分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA的合成，將其加到端粒的3端，以維持端粒長(zhǎng)度及功能。其催化過(guò)程為：（1）結(jié)合：端粒酶分子的RNA重復(fù)序列與DNA端粒末端按照互補(bǔ)原則結(jié)合。（2）延伸：以端粒酶分子的RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄作用，使DNA分子上的端粒延伸。（3）移位：端粒酶移動(dòng)到延伸后的端粒末端。重復(fù)上述過(guò)程，反復(fù)進(jìn)行，使端粒不斷延伸。5、答

39、：抗體酶的合成主要是由抗原誘導(dǎo)合成的，包括半抗原誘導(dǎo)法和酶蛋白誘導(dǎo)法。（1）半抗原誘導(dǎo)法。這種方法是以預(yù)先設(shè)計(jì)的過(guò)渡態(tài)類似物作為半抗原，與載體蛋白偶聯(lián)制成抗原，然后免疫動(dòng)物，再經(jīng)過(guò)單克隆抗體制備技術(shù)制備、分離、篩選得到所需的抗體酶。（2）酶蛋白誘導(dǎo)法。酶蛋白誘導(dǎo)法是以某種酶蛋白作為抗原誘導(dǎo)抗體酶產(chǎn)生的方法。首先選定一種酶蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，在酶蛋白抗原的誘導(dǎo)下，動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生與酶分子特異結(jié)合的抗體，再將獲得的酶抗體來(lái)免疫該動(dòng)物，并采用單克隆抗體制備技術(shù)得到與酶抗體特異結(jié)合的抗抗體。那么，抗抗體結(jié)合部位的構(gòu)象與用作抗原的酶分子的結(jié)合中心的構(gòu)象相同。對(duì)抗抗體進(jìn)行篩選，就有可能獲得具有催化活性的抗體

40、酶。6、答：植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）提高產(chǎn)率。使用高產(chǎn)、穩(wěn)定的植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可明顯提高天然產(chǎn)物產(chǎn)率。（2）縮短周期。植物細(xì)胞生長(zhǎng)的倍增時(shí)間一般為12-60 h，發(fā)酵周期15-30天，與完整植物的生長(zhǎng)周期比較，大大縮短了生產(chǎn)周期。（3）易于管理，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度。培養(yǎng)在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行，不受地理環(huán)境和氣候條件的影響，易于操作管理。（4）提高產(chǎn)品質(zhì)量。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要產(chǎn)物的產(chǎn)率較高，雜質(zhì)少，易于分離。（5）與微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中具有對(duì)剪切力敏感的缺點(diǎn)。7、答：以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例，具體步驟如下：（1）大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)

41、實(shí)、飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后無(wú)菌水漂洗3次。 在無(wú)菌條件下，切成0.5cm3的小塊，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固體MS培養(yǎng)基中，在25，600lux，12h/d光照條件下培養(yǎng)18d，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每18天繼代一次。（2）大蒜懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 將上述在半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d的愈傷組織，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA（芐基腺嘌呤） 的液體MS培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25，600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d，使愈傷組織分散成為小細(xì)

42、胞團(tuán)或單細(xì)胞。 然后在無(wú)菌條件下，經(jīng)過(guò)篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液體MS培養(yǎng)基中，25,600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d。（3）酶的分離純化 細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。8、答：以人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原活化劑為例，具體步驟為：（1）人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)1）將人黑色素瘤的種質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶消化處理，細(xì)胞分散后，用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌，計(jì)數(shù)，稀釋成細(xì)胞懸浮液。2）在消毒好的反應(yīng)器中裝進(jìn)一定量的培養(yǎng)液，將上述細(xì)胞懸浮液接種至反應(yīng)器中，接種濃度為（13）103個(gè)細(xì)胞/mL，

43、于37的CO2培養(yǎng)箱中，通入含5%CO2的無(wú)菌空氣，培養(yǎng)至長(zhǎng)成單層致密細(xì)胞。3）傾去培養(yǎng)液，用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞23次。4）換入一定量的無(wú)血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。5）每隔34 d，取出培養(yǎng)液進(jìn)行tPA的分離純化。6）再向反應(yīng)器中加入新鮮的無(wú)血清的Eagle培養(yǎng)液（最低必需培養(yǎng)液）繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得大量的tPA。（2）組織纖溶酶原活化劑的分離純化在獲得的上述培養(yǎng)液中加入一定量的蛋白酶抑制劑和表面活性劑，過(guò)濾去沉淀，適當(dāng)稀釋后，采用親和層析技術(shù)進(jìn)行分離（以tPA抗體為配基，以溴化氫活化的瓊脂糖凝膠電泳為母體制成親和層析劑，上柱、洗滌后用3mol/LKSCN溶液洗脫，分部收集），得

44、到tPA溶液。經(jīng)過(guò)濃縮、葡聚糖G-150凝膠層析、冷凍干燥，得到精制的tPA干粉。 第四章 酶的提取與分離1、 名詞解釋ATPE：Aqueous two phase system雙水相萃取技術(shù)，是利用聚合物-鹽或聚合物-聚合物混合系統(tǒng)所出現(xiàn)的兩相不相混溶的水相進(jìn)行萃取的操作技術(shù)。IEC：離子交換層析，是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。HPLC：高壓液相層析，采用高壓輸液系統(tǒng)，利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無(wú)數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的方法。2DE：雙向凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量大小，分別在

45、凝膠介質(zhì)二維空間上對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行等電點(diǎn)聚焦和SDS-PAGE來(lái)分離與純化蛋白質(zhì)的方法。 電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程稱為電泳。電滲：在電場(chǎng)中，溶液對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)為電滲。層析：是利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子額大小和形狀、分子的極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等)的不同，使各組分以不同比例分布在固定相和流動(dòng)相兩相中的技術(shù)。2、細(xì)胞破碎的方法有哪些？原理是什么？ 答：有四種 （1)、機(jī)械破碎法，包括搗碎法、研磨法、勻漿法。原理：通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織細(xì)胞破碎。 （2）、物理破碎法，包括溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法。原理：

46、通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。 （3）、化學(xué)破碎法，包括添加有機(jī)溶劑和添加表面活性劑。原理：通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，從而使細(xì)胞破碎。 （4）、酶促破碎法，包括自溶法和外加酶制劑法。原理：通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破環(huán)，從而達(dá)到細(xì)胞破碎。3、 簡(jiǎn)述酶的提取方法及影響酶提取的主要因素。 答：主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶液提取。 主要影響因素：溫度、PH、提取液的體積。4、 簡(jiǎn)述差速離心和密度梯度離心分離酶的原理及各自特點(diǎn)。 答：差速離心原理：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離

47、特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒，操作簡(jiǎn)單、方便。但是分離 效果較差， 不能一次得到純顆粒，壁效應(yīng)嚴(yán)重，并使沉降的顆粒受到擠壓。 密度梯度離心原理：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分 得以分離，當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場(chǎng)下，在 密度梯度介質(zhì)中，顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏细∑穑恢币苿?dòng)到 與它們各自的密度恰好相等的位置，形成一系列密度區(qū)，從而 使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。 特點(diǎn)：（1）區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。 （2）適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。5、 簡(jiǎn)述雙水相萃取和反膠束萃取、超臨界流體萃取的原理及各自特點(diǎn)。 答：雙水相萃取原理：

48、利用不同溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度不同的原理而達(dá) 到分離。 特點(diǎn)：1）每一水相中均有很高的含水量，為酶等生物物質(zhì)提供了一個(gè)良 好的環(huán)境；2）高分子聚合物的水溶液對(duì)酶等無(wú)毒害作用，不會(huì)引 起變性。3）分離后酶濃度低，需經(jīng)過(guò)濃縮等以提高濃度。4）雙水 相系統(tǒng)中含有高分子聚合物或鹽類，分離后需進(jìn)一步進(jìn)行分離 化，以除去分子聚合物或鹽類等雜質(zhì)。 反膠束萃取原理：將表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過(guò)臨界膠束濃度，形成 反膠束，利用反膠束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來(lái)。 特點(diǎn)：1）萃取率和反萃取率高。2）分離濃縮同時(shí)進(jìn)行，溶劑可反復(fù)利用。 3）解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活問(wèn)題。4）破壁

49、功能，直接 從完整細(xì)胞提取酶蛋白。5）成本低。 超臨界流體萃取原理：利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離， 溶解度大的物質(zhì)溶解在超臨界流體中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì) 分開(kāi)，然后通過(guò)升高溫度或降低壓力，使超臨界流體變?yōu)闅鈶B(tài)而得 到所需物質(zhì)。 特點(diǎn)：(1)萃取速度高與液體萃取，特別適合于固態(tài)物質(zhì)的分離提取；(2) 在接近常溫的條件下操作，適合于熱敏性物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的分離； (3)傳熱速率快溫度易于控制；(4)適合于揮發(fā)性物質(zhì)的分離；5）超 臨界流體萃取萃取速度快，對(duì)物質(zhì)的萃取具有選擇性，萃取后易分 離。6、 如何理解灌注色譜是生物大分子分離純化的一個(gè)重大突破，并以酶為例加以

50、說(shuō)明。 答：灌注色譜法就是采用大孔填料，在高流速下產(chǎn)生溶質(zhì)隨流動(dòng)相穿透填料粒子的傳質(zhì)方式的新型色譜技術(shù)。這種介質(zhì)一個(gè)突出特點(diǎn)是孔內(nèi)“停滯流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力”大大減小。這是因?yàn)轭w粒內(nèi)的傳質(zhì)過(guò)程主要靠穿透孔內(nèi)的對(duì)流傳遞，生物大分子溶質(zhì)能隨流動(dòng)相的液流迅速達(dá)到孔內(nèi)的活性表面。降低了溶質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)停留的限制，明顯的縮短了蛋白質(zhì)的分離時(shí)間。無(wú)論是分析色譜還是制備色譜，進(jìn)行時(shí)得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量、產(chǎn)量、產(chǎn)率都有所提高。在高流速下也不會(huì)因?yàn)閭髻|(zhì)太慢而使譜帶展寬。能以比HPLC快10-100倍的速度在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行生物大分子的分離，同時(shí)分離度和柱容量損失小，特別適用于生物大分子的快速分析和規(guī)模制備。 例如用POROS

51、R/M填料能在較短時(shí)間內(nèi)完成含有核糖核酸酶、卵清蛋白等蛋白質(zhì)混合物的快速分離。7. 簡(jiǎn)述結(jié)晶與沉淀的區(qū)別，酶結(jié)晶的基本原理及影響結(jié)晶的主要因素。答：沉淀為初分離過(guò)程，結(jié)晶一般為分離的后續(xù)步驟，屬于成品化過(guò)程。1）區(qū)別：形態(tài)的不同，同類分子或離子以有規(guī)則排列形式而析出稱結(jié)晶，同類分子或離子以無(wú)規(guī)則的紊亂排列形式而析出稱沉淀。酶結(jié)晶原理：酶液濃度處于稍微過(guò)飽和狀態(tài)下會(huì)發(fā)生結(jié)晶（酶濃度過(guò)低無(wú)法析出結(jié)晶，過(guò)高會(huì)形成許多小晶核，結(jié)晶小不易長(zhǎng)大）。2）影響因素：(1)純度：純度越高越易結(jié)晶（ 50）純度是指所需要的組分在樣品總量中所占的比例(一船為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。雜質(zhì)占比例越低，則所制備物質(zhì)的純度越高。各種物

52、質(zhì)在溶液中均需達(dá)到一定的純度才能析出結(jié)晶，這樣就可使結(jié)晶和母液分開(kāi)，以達(dá)到進(jìn)一步分離純化的目的。生化產(chǎn)品也不例外，一般說(shuō)來(lái)純度愈高愈易結(jié)晶。就蛋白質(zhì)和酶而言，結(jié)晶所需純度不低于50，總的趨勢(shì)是越純?cè)揭捉Y(jié)晶。結(jié)晶的制品并不表示達(dá)到了絕對(duì)的純化，只能說(shuō)達(dá)到了相當(dāng)純的程度。但有時(shí)純度雖不高，若加入有機(jī)溶劑和制成鹽時(shí)，也能得到結(jié)晶。(2)濃度：濃度越高越易結(jié)晶，控制在飽和區(qū)以上，過(guò)飽和區(qū)以下的介穩(wěn)區(qū)內(nèi)。結(jié)晶液一定要有合適的濃度，溶液中的溶質(zhì)分子或離子間便有足夠的相碰機(jī)會(huì)，并按一定速率作定向排列聚合才能形成晶體。但濃度太高達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，溶質(zhì)分子在溶液中聚集析出的速度太快，超過(guò)這些分子形成晶體的速率，相

53、應(yīng)溶液粘度增大，共沉物增加，反而不利于結(jié)晶析出，只獲得一些無(wú)定形固體微粒，或生成純度較差的粉末狀結(jié)晶。結(jié)晶液濃度太低，樣品溶液處于不飽和狀態(tài)，結(jié)晶形成的速率遠(yuǎn)低于晶體溶解的速率，也得不到結(jié)晶。因此只有在稍過(guò)飽和狀態(tài)下，即形成結(jié)晶速率稍大于結(jié)晶溶解速率的情況下才能獲得晶體。結(jié)晶的大小、均勻度和結(jié)晶的飽和度有很大關(guān)系。(3)pH值pH值的變化可以改變?nèi)苜|(zhì)分子的帶電性質(zhì)，是影響溶質(zhì)分子溶解度的一個(gè)重要因素。在一般情況下，結(jié)晶液所選用的pH 值與沉淀大致相同。蛋白質(zhì)、酶等生物大分子結(jié)晶的pH 值多選在該分子的等電點(diǎn)附近。如溶菌酶的等電點(diǎn)為11.011.2，5溶菌酶溶液，pH 值9.510，在4放置過(guò)夜

54、便析出結(jié)晶。如果結(jié)晶時(shí)間較長(zhǎng)并希望得到較大的結(jié)晶時(shí)，pH 值可選擇離等電點(diǎn)遠(yuǎn)一些，但必須保證這些分子的生物活性不受損害。(4)溫度冷卻的速度及冷卻的溫度直接影響結(jié)晶效果冷卻太快引起溶液突然過(guò)飽和，易形成大量結(jié)晶微粒，甚至形成無(wú)定形沉淀。冷卻的溫度太低，溶液濃度增加，也會(huì)干擾分子定向排列，不利于結(jié)晶的形成。生物大分子整個(gè)分離純化過(guò)程，包括結(jié)晶在內(nèi)，通常要求在低溫或不太高的溫度下進(jìn)行。低溫不僅溶解度低，而且不易變性，并可避免細(xì)菌繁殖。在中性鹽溶液中結(jié)晶時(shí)，溫度可在0至室溫的范圍內(nèi)選擇。(5)時(shí)間結(jié)晶的形成和生長(zhǎng)需要一定時(shí)問(wèn)，不同的化合物，結(jié)晶時(shí)間長(zhǎng)短不同。蛋白質(zhì)、酶等生物大分子結(jié)晶時(shí)，由于分子內(nèi)有

55、許多功能基團(tuán)和活性部位，其結(jié)晶的形成過(guò)程也復(fù)雜得多。簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)或有機(jī)分子形成晶核時(shí)需要幾十甚至幾百個(gè)離子或分子組成。但蛋白質(zhì)分子形成晶核時(shí)，只需很少幾個(gè)分子即可，不過(guò)這幾個(gè)分子整齊排列成晶核時(shí)比幾十個(gè)、幾百個(gè)分子、離子所費(fèi)時(shí)間多得多，所以蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子形成結(jié)晶常需要較長(zhǎng)時(shí)間，因此經(jīng)常需要放置。在生化產(chǎn)品制備中，時(shí)間不宜太長(zhǎng)，通常要求在幾小時(shí)之內(nèi)完成，以縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。(6)晶種不易結(jié)晶的生化產(chǎn)品常需加晶種。有時(shí)用玻璃棒摩擦容器壁也能促進(jìn)晶體折出。8. 試論述如何利用本章所學(xué)的各種分析技術(shù)對(duì)特定的蛋白酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)（如分子質(zhì)量、pI、帶電狀態(tài)、亞基組成、溶解性等）研究。答：1、熒光探針技術(shù)不但可以對(duì)原來(lái)不發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行極微量的測(cè)定，而且利用它的特異性結(jié)合對(duì)環(huán)境的敏感， 可為生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究，提供很多有用的信息。1）、蛋白質(zhì)疏