飼料中的氨基酸分析

1、Welch Materials, Inc.飼料中的氨基酸分析一. 儀器及試劑儀 器：1). 天平一臺（精度0.1mg）；2). 恒溫水浴鍋一臺；3). 容量瓶；4). 試管（1.515cm或1.510cm）；5). 微量進樣器（5L或10L）一支；6). 微量可調(diào)移液槍（1000uL，200L）一支、吸頭多個；7). 旋渦混勻器一臺；8). HPLC系統(tǒng)及氨基酸分析專用柱（4.6250mm 5m）；試 劑：1). 超純水（18Mcm）；2). 乙腈（HPLC級）；3). 三水合醋酸鈉（分析純）；4). 冰醋酸（分析純）；5). 衍生試劑A和衍生試劑B溶液，至于冰箱保存（衍生試劑包對身體有害，用

2、時請做好防護措施）；6). 正己烷（HPLC級）。7). 0.1mol/L鹽酸溶液：精密量取9.0mL濃鹽酸，加去離子水稀釋至1000mL。8）6mol/L鹽酸溶液:精密量取濃鹽酸溶液，加到去離子純化水以等比例混合，（再加入0.1%的苯酚試劑作為保護劑）。二. 流動相的配制流動相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）：乙睛93.0：7.0配制方法：準確稱取三水合醋酸鈉13.6g于1000mL水中，攪拌均勻，使之溶解，用冰醋酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.50；準確量取配制好的三水合醋酸鈉溶液930mL和乙腈70mL，混合均勻，抽濾過0.22m濾膜； 流動相B：水：乙腈20.0：80.0

3、配制方法：準確量取水200mL和乙腈800mL，混合均勻，抽濾過0.22m濾膜；三. 衍生化反應(yīng)1. 對照品溶液濃度值NameM.W.C(Mmol/L)NameM.W.C(Mmol/L)門冬氨酸133.102.50胱氨酸240.31.25谷氨酸147.132.50氯化銨53.492.50絲氨酸105.092.50酪氨酸181.192.50甘氨酸75.0672.50纈氨酸117.152.50組氨酸155.152.50蛋氨酸149.212.50精氨酸174.202.50異亮氨酸131.172.50蘇氨酸119.122.50亮氨酸131.172.50丙氨酸89.0932.50苯丙氨酸165.192.

4、50脯氨酸115.132.50賴氨酸146.192.502. 供試品溶液制備精密稱取飼料粉末樣品100mg，置于50ml的圓底燒瓶中，加入10ml的6mol/L鹽酸溶液，溶解，并在110度條件下加熱回流反應(yīng)24小時，反應(yīng)完成后，放置冷卻；冷卻完后轉(zhuǎn)移至100ml的量瓶中，加水分別3次潤洗反應(yīng)瓶，收集到量瓶中定容至100ml；充分混勻，再量取50ml的溶液蒸干，并用2ml水潤洗定容，待衍生用。3. 衍生步驟1）分別將A、B兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的1/5倍；2）精密量取上述對照品溶液200L，置于試管中，加入稀釋后的A溶液100L和稀釋后的B溶液100L，搖勻，室溫反應(yīng)60min；然后

5、加入正己烷溶液400L旋緊蓋子后振搖510s，室溫靜置分層，取下層200L溶液，加入800L水混合均勻，再取200L加入800L水混合均勻，用孔徑為0.22m有機膜過濾，待分析；3）供試品的衍生：供試品溶液200L，置于試管中，加入稀釋后的A溶液100L和稀釋后的B溶液100L，搖勻，室溫反應(yīng)60min；然后加入正己烷溶液400L旋緊蓋子后振搖510s，室溫靜置分層，取下層200L溶液，加入800L水混合均勻，再取200L加入800L水混合均勻，用孔徑為0.22m有機膜過濾，待分析；（注意：供試品樣品前處理采用酸解提取，需要在衍生之前進行酸揮干處理，供試品中酸性強度過大在衍生過程中會發(fā)生中和，

6、衍生過程必須在堿性條件下，才能夠起到衍生化完全。）四. 色譜條件1. 色譜柱：月旭 Amino Acid，5m，4.6250mm；2. 梯度程序：流動相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.50）：乙睛93：7流動相B： 水：乙腈20：80T(min) A% B%0.01 100.0 0.011 93.0 7.013.9 88.0 12.014 85.0 15.029 66.0 34.032 30.0 70.035 0.0 100.042 0.0 100.045 100.0 0.0 60 100.0 0.0流速：1.0mL/min柱溫：40 波 長：254nm 進樣量：10L 工作站記錄

7、時間：60min 五色譜圖：1. 空白2. 混標1. 門冬氨酸8. 丙氨酸 15. 異亮氨酸2. 谷氨酸9. 脯氨酸16. 亮氨酸3. 絲氨酸10氯化銨 17. 正亮氨酸4. 甘氨酸 11. 酪氨酸 18. 苯丙氨酸5. 組氨酸 12. 纈氨酸19. 賴氨酸6. 精氨酸 13. 蛋氨酸7. 蘇氨酸 14. 胱氨酸3. 飼料樣品六測定結(jié)果：氨基酸名稱%含量門冬氨酸3.498786谷氨酸5.898341絲氨酸1.873169甘氨酸3.234552組氨酸2.383998精氨酸2.379407蘇氨酸1.119227丙氨酸2.498554脯氨酸3.598812氯化銨2.315001酪氨酸2.071032纈氨酸2.514268蛋氨酸1.074694胱氨酸0異亮氨酸2.510713亮氨酸4.156157苯丙氨酸2.717075賴氨酸2.786941五. 操作步驟和注意事項1. 操作步驟：1）設(shè)置柱溫40和流速1.0mL/min；2）將A、B兩個通道用乙腈：水20：80排盡氣泡（如B通道的原存留液中不含緩沖鹽，則無需用乙腈：水20：80排氣泡），B通道用流動相B再排盡氣泡；3）用乙腈：水20：80（A通道）沖洗系統(tǒng)20min，以防止緩沖鹽析出；4）A通道用流動相A排盡氣泡，然后用流動相A走基線30min，平衡色譜柱；5）運行一次空白梯度； 6）進樣分析；