高效液相色譜法測定虎杖中白藜蘆醇的含量

1、反相高效液相色譜法測定虎杖中白藜蘆醇的含量白祖海，文剛，張艷長沙市疾病預防控制中心，長沙 410001 )摘要：采用HPLC法測定虎杖中白藜蘆醇含量。以聚酰胺柱對樣品進行預處理，排除其它成分的干擾，獲得較好分離度和高回收率。選用自填裝ODS-C 18色譜柱(200 mm X4.6 mm , 5 阿)，以乙醇-水(2 : 3,v/v)作流動相，流速為0.6 ml/min，紫外光檢測波長304nm，柱溫為25 C。白藜蘆酵在0.05-0.40 pg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系。r=0.9996，平均回收率為 98.51%(n=5) 。結論：該方法簡便、準確可靠，適合于中藥材虎杖中白藜蘆醇含量的測

2、定。關鍵詞：白藜蘆醇；虎杖；反相高效液相色譜法Determination of Resveratrol in the Polygonum Cuspidatum byReversed-Phase HPLCBAI Zu-hai, WEN Gang, ZHANG Yan(Changsha Municipal Center for Prevention and Control of Diseases, Changsha 410001,China)Abstract ： A simple and sensitive Reversed-Phase HPLC method for the determinat

3、ion of resveratrol in the roots of Polygonum cuspidatum was described ，including the pretreatment of samples by poamide colutah. The separation wasPerformed on an ODS column(200 mm >4.6 mm，5 p m) with the mobile phase ofCH3CH2OH-H2O (2： 3,v/v).The flow rate 0.6 ml/min and the detection wavelength

4、 was 304 nm, the temp erature of the p illar is in door temp erature. Resveratrol have good linear relationship in the range of 0.05-0.40 卩 g (r=0.9996).The average recoveries(n=5)of resveratrol were98.51%.A simpie, accurate and sensitive method with good reproduciability to determine resveratrol si

5、multaneously in Polygonum cus pidatum Sieb.et Zucc.is establishedKeywords : Resveratrol; P olygo num cus pi datum； Reversed-P has曲 PLC.虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc是蓼科蓼屬植物，廣泛分布于華東、中南、遼陜甘川滇等地?；⒄雀o中主要含有蒽醌類和芪類化合物，其中芪類成收稿日期：2011-09-28修訂日期：2012-07-20作者簡介：白祖海（1978 ），男，湖南岳陽人，長沙市疾病預防控制中心，主管檢驗師，碩士學位分白

6、藜蘆醇（resveratrol和白藜蘆醇苷（piceid），具有活血定痛、清熱利濕、止咳 化痰作用。白藜蘆醇具有抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗菌、調(diào)節(jié)脂類代 謝、保護心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等多種功能 ，被列為抗心血管病、抗癌最有前 途的藥物之一?；⒄戎邪邹继J醇含量最高3。目前對白藜蘆醇的測定方法不少4,5，主要有分光光度法、膠束薄層色譜法7、電化學發(fā)光法8、高速逆流色譜法8-9、高效液相色譜法10-11等。建立準確可靠和簡便的測定虎杖中白藜蘆醇的含量方法對于虎杖資源的充分開發(fā)利用產(chǎn)生重要的實際意義，為其研究開發(fā)提 供科學的依據(jù)。本研究對虎杖樣品進行初步處理，以乙醇 -水為流動相，建立了測定虎杖中

7、白藜蘆醇的反相高效液相色譜方法， 該測定方法操作簡單，測定結果 穩(wěn)疋可靠。1 實驗部分1.1 儀器與試劑HLPC Pump 裝柱機（ BT3020 ，德國）；高效液相色譜儀（安捷倫， 1200系列，美國）,RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；WF-4000微波系統(tǒng)（上 海屹堯分析儀器有限公司）；高頻數(shù)控超聲波發(fā)生器 （KQ80TDB 型, 昆山市超 聲儀器有限公司 ）, FA2104 型電子天平。乙醇（色譜純，湖南師大試劑廠 ）；乙醇 （化學純，湖南師大試劑廠 ）；乙酸乙酯（分析純，和氏璧化工）；白藜蘆醇對照品 （美國 Sigma 公司，純度 99）；虎杖藥材購自湖南九芝堂藥材公司。

8、1.2 溶液的制備1.2.1 對照品溶液的配制稱取白藜蘆醇 2.5 mg ，置 25ml 容量瓶中， 乙醇溶解， 并稀釋至刻度。 搖勻， 得含白藜蘆醇 0.10 mg/ml 的混合對照品儲備液，冷藏備用。1.2.2 虎杖的預處理根據(jù)虎杖中自藜蘆醇、 白藜蘆醇苷和大黃素的結構和性質的差異， 采用乙 醇溶液超聲提取，利用極性適中的乙酸乙酯再提取，三種組分的回收率比較高。提取結果表明：采用乙醇超聲初提取和乙酸乙酯二次提取比單獨采用乙醇浸提或 回流提取的回收率高。 如最后采用氯仿提取， 乳化現(xiàn)象較嚴重， 且結果與乙酸乙 酯提取相比較差。 可以同時測定白藜蘆醇、 白藜蘆醇苷和大黃素的含量， 并防止 白藜

9、蘆醇苷水解。1.2.3 樣品溶液的制備本實驗采用常規(guī)的加熱回流方法提取白藜蘆醇來建立標準曲線：虎杖粉末過4 0目篩，精密稱取虎杖粉末5 0 g，用95%乙醇水浴回流提取三次，第一次用 250ml乙醇回流提取3h，第二、三次分別用200ml乙醇回流提取各Ih，合并提取液，冷卻，過濾，濾液減壓濃縮至月50ml后加蒸餾水200 ml，水浴揮發(fā)去殘余乙醇,保溫30min后過濾。濾液上聚酰胺柱，大量蒸餾水沖至無色后，用10%乙醇沖洗, 待顏色沖淡后用3 0%乙醇沖洗，收集30%乙醇沖洗液，減壓蒸餾濃縮并定容于 100 ml容量瓶中，精密吸取上述溶液l ml，置10ml容量瓶中，乙醇稀釋至刻度。為了對比常

10、規(guī)的加熱回流方法提取白藜蘆醇提取率的不同，本文還采用微波 法來提取白藜蘆醇：虎杖粉末預處理后過 40目篩，精密稱取虎杖粉末5 0 g，用95%乙醇浸泡1h后，在功率600W下微波處理5次，每次1min ,間歇時間為2min ,使提取溫度不超過30oC。微波處理后余下的步驟與加熱回流方法一致。圖1白藜蘆醇對照品和樣品液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms for standard resveratrol and extraction solution of Polygonum cuspidatum2 結果與討論2.1 色譜條件色譜柱：選用0DS-C18色譜柱(200 mm

11、X4.6 mm , 5阿)；流動相：乙醇-水(2:3，V/V);流速：0.6 ml min-1 ;檢測波長：304 nm ;柱溫為室溫；進樣量10 M。在此條件下，作白藜蘆醇對照品色譜圖。樣品溶液以相同條件進樣，根據(jù)對照品白藜蘆醇的保留時間初步確定樣品溶液中白藜蘆醇的特征峰。 白藜蘆醇的 出峰時間為 3.05min ，與其他組分的色譜峰可以達到基線分離。此條件下白藜蘆 醇的理論塔板數(shù)均不低于 3000 。對照品及樣品液相色譜圖見圖 1。2.2 標準曲線的繪制精密吸取混合對照品儲備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，置10ml容量瓶中,乙醇稀釋至刻度，制成不同濃度的混合對照品溶液。按

12、“2.2色譜條件”測定峰面積積分值，以峰面積積分值丫為縱坐標，對照品進樣量X為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，計算回歸方程。白藜蘆醇的線性回歸方程及相關系數(shù)為：丫= 9.464X10 -5X+ 0.225式中，X為白藜蘆酸質量濃度，單位為卩g/mL ; 丫為色譜峰面積，單位為 mm 2，線性回歸系數(shù) r=0.9996 ，最小檢出限為 10ng/mL 。試驗結果表明，白藜 蘆醇在0.05-0.40 ug/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關系。2.3 虎杖中白藜蘆醇含量測定對同一批藥材精密稱取 5份，按2.1 溶液配制方法制備樣品溶液。 將制備好的 待測溶液按上述色譜條件進樣，根據(jù)峰面積計算該樣品溶液中白

13、藜蘆醇的含量。計算公式為n=(a/b) X100%。其中n為白藜蘆醇的含量(g) ； a為白藜蘆醇質量（g） ； b為虎杖粗粉的質量（g）。計算平均值得到虎杖中白藜蘆醇的含量為0.3500% (見表 1)。表1虎杖中白藜蘆醇含量的測定序號加入量（g）白藜蘆醇（%）120.00250.3501220.04720.3496320.03650.3502419.98940.3498520.01480.3504Tab. 1 Determ in ati on of Resveratrol in the Po lyg onum Cusp idatum2.4加樣加標回收試驗依次配制白藜蘆醇對照品溶液、樣品溶液

14、和樣品加對照品溶液,按上述方法測定其含量。將所得的5份供試品溶液按“色譜條件”項下進行測定,每份樣品測定5次，計算加樣回收率。測得平均回收率為 98.51% ;相對誤差(RSD)為0.2279%，回收效果很好（見表2）。表2回收率試驗結果序號加入量（卩g）測得量（卩g）回收率（%）平均回收率相對誤差13.203.1698.7527.407.3198.7898.51%0.2279%311.2011.0398.48Tab. 2 Result of recovery ratio16.2015.9798.5822.8022.3497.985個樣2.5重復性試驗精密稱取樣品5份，按上述方法制備樣品溶液和

15、做液相色譜檢測，計算品中虎杖中白藜蘆醇的平均含量為0.3506%，相對誤差RSD為2.56%。實驗結果見表3?？梢钥闯?，檢測結果表現(xiàn)出很好的重復性，實驗誤差在允許范圍內(nèi)。據(jù)此認為可將此法用于實際樣品分析。表3重復性試驗結果Tab. 3 Results of rep eatability test序號力卩入量（g）白藜蘆醇（%）相對誤差（RSD）120.02360.3485220.03250.35482.560%319.98970.3493420.00480.3509520.00420.34952.6穩(wěn)定性試驗及提取方法的影響2.6.1對同一供試品溶液在8 h之內(nèi)每隔1 h測定峰面積，試驗結果表

16、明。白藜蘆醇色譜峰面積無明顯變化，其峰面積積分值的相對誤差RSD分別為1.196 %，表明樣品的溶液穩(wěn)定性很好。2.6.2由于白藜蘆醇對光熱較敏感易分解，用常規(guī)法提取時活性受影響，且提取率低，故采用微波提取法。微波提取是近年才發(fā)展起來的一項新技術，與常規(guī)提取相比，其最大特點是作用時間短、速度快、提取效率高、提取溫度低（V45 C ）。微波用于虎杖白藜蘆醇的提取，可最大限度地避免提取過程中受光、 熱影響而分解，提取率大大提高。本實驗在加熱回流辦法建立標準曲線的基礎上， 采用微波提取法來提取白藜蘆醇，來對比其與常規(guī)浸提法對白藜蘆醇提取率的影響。表4為常規(guī)浸提法和微波法對白藜蘆醇的提取對比。 可見微

17、波法對白藜蘆醇的提取具有效率和得率高的優(yōu)點。表4提取方法對虎杖鮮根莖白藜蘆醇提取率的影響Table 4 In flue nee of extract ion method for resveratrol on yield提取方法提取時間（min ）提取溫度C）提取物中白藜蘆醇含量得率（%）常規(guī)浸提法60450.3212%80.24微波法5400.3546%96.282.7結論2.7.1虎杖成分極其復雜12,不經(jīng)預處理難以獲得理想的分離效果，從而影響白藜蘆醇含量測定結果的準確性。本文采用聚酰胺柱子預處理提取液成功地排除了其它組分的干擾，再進行HPLC檢測，獲得較好的分離度，且回收率高，因此本法可

18、用作虎杖中自藜蘆醇含量的分析檢測方法。2.7.2測定結果表明，虎杖中自藜蘆醇含量可高達 0.3500%，我國虎杖資源十分豐富，虎杖可作為白藜蘆醇提取的主要原料。2.7.3 乙腈具有較強的毒性，對環(huán)境和試驗人員造成一定的傷害。本研究改選用無污染的乙醇-水體系，試驗結果證明，本研究建立的HPLC法，樣品經(jīng)過預處理,為測定中草藥及其相關產(chǎn)品中白藜蘆醇提供了可靠的測定方法。 該測定方法靈敏度高、重復性好、 簡便實用， 為虎杖和含白藜蘆醇類中成藥的有效成分的質量評價和控制提供了快速分析方法 。參考文獻 :1 yoshlyuki kimuLa,Chohachi Konno,Masayasu Kimura.

19、 New constituent of rootsof Polygonum cuspidatumJ.Planta Med,l983,48(3):l64-1692Yoshiyuki Kimura,Sakuji Ko. Effects of stilbene componentsof roots ofPolygonum cuspidatum on liver injury in peroxidized oil-fedratsJ.PlantaMed,1983,48(1):51-54.3GANINI S J,HIRNTHI J,EUNG S L,et a1.Kinase inhibitors fromPolygonumcuspidatumJ. J Nat Prod.,1993,56(10):l805-l810.4石明睿 .虎杖中白藜蘆醇提取、純化生產(chǎn)工藝的研究D. 湖南中醫(yī)藥大學 ,2008.朱鴻津.HPLC法測定虎杖中白藜蘆醇的含