質(zhì)粒DNA提取純化及驗證

1、【實驗?zāi)康摹?、掌握堿變性提取質(zhì)粒DNA法的原理、過程及各種試劑的作用。2、掌握凝膠電泳對DNA別離純化的原理和方法?！緦嶒炘怼?、提取、純化質(zhì)粒DNA堿變性提取法提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、 羥基磷灰石柱層析法、EB一氯化葩密度梯度離心法和 Wizard法等。其中，堿變 性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒 DNA的提取。該方法操作簡單，易 于操作，一般實驗室均可進(jìn)展。提取的質(zhì)粒 DNA純度高，可直接用于酶切、序 列測定及分析。堿變性提取質(zhì)粒 DNA 一般包括三個根本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以 擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；別離和純化質(zhì)粒DNA 0在細(xì)菌細(xì)胞

2、中，染色體DNA以雙螺旋構(gòu)造存在，質(zhì)粒 DNA以共價閉合環(huán) 狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體 DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者 變性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12. 0的堿性溶液中，染色 體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋構(gòu)造解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大局部氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全別離。當(dāng)用pH值4. 6的KAc（或NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒 DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺 旋構(gòu)造而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、 蛋白質(zhì)一 SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過 離心，與復(fù)性的溶

3、于溶液的質(zhì)粒 DNA別離。溶于上清液的質(zhì)粒 DNA,可用無 水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于 DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉 淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNase A將RNA降解。質(zhì)粒DNA 溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純 度較高的質(zhì)粒DNA 02、瓊脂糖凝膠電泳電泳electrophoresis）!帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移 動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中 會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的 凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，

4、移動的速度可因電離子的大小、 形態(tài) 及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。 因而，凝膠電泳可用于別離、鑒定和純化 DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù) 之一'o凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨圍極廣。止匕外，凝膠中DNA 的位置可以用低濃度熒光插入染料如澳化乙錠 （EB）或SYBR Gold染色直接觀察 到，甚至含量少至20 Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。 需要的話， 這些別離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實驗。分子生物學(xué)實驗中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝 膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也

5、能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)展電泳。瓊 脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定 DNA的相對分子質(zhì)量，別離經(jīng) 限制酶水解的DNA片段，進(jìn)一步純化DNA等。瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的 方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面 6個因素：1產(chǎn)品DNA分子的大小：電泳時，線性雙螺旋 DNA分子是以頭尾位向前 遷移的，具遷移速度與相對分子質(zhì)量（所含堿基）的對數(shù)值成反比，這是因為大分子有更大的摩擦阻力。2)DNA分子的構(gòu)象：相對分子質(zhì)量一樣而構(gòu)象不同的 DNA分子，其遷移速 率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超

6、螺旋的共價閉合 環(huán)狀構(gòu)造的質(zhì)粒 DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)的一條鏈斷裂，變 成開環(huán)DNA(open circle DNA , oeDNA)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€ 狀DNA(1iner DNA , L DNA)分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情 況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。3加脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的 DNA片段在 不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。 通常凝膠濃度越低，那么凝膠孔徑越 大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃

7、度應(yīng)越 低。4)電泳所用電場：低電壓條件下，線性 DNA片段的遷移速率與所用電壓成 正比，電壓越高，帶電顆粒泳動越快，但隨著電場強(qiáng)度的增加，不同長度DNA泳動的增加程度不同，因此凝膠電泳別離 DNA的有效圍隨著電壓上升而減少。 為了獲得DNA片段的最正確別離效果，電場強(qiáng)度應(yīng)小于 5 V/cm。5)緩沖液：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率。當(dāng)電泳液為去離子水 (如不慎誤用去離子水配制凝膠)，溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動很慢，DNA 幾乎不移動；而在高離子強(qiáng)度下(如錯用10X電泳緩沖液)，導(dǎo)電性極高，帶電顆 粒泳動很快，產(chǎn)生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使 DNA變性。電泳時常用的 緩沖液有乙

8、酸鹽TAE、硼酸鹽TBE)和磷酸鹽TPE幾種不同的緩沖液， 通常配制成10X或5X的濃度母液保存于室溫下，用時稀釋至工作濃度。TAE緩沖液緩沖能力弱，長時間電泳緩沖能力逐漸喪失 陽極變堿性，陰極變酸性， 長時間電泳需要更換緩沖液。TAE緩沖液可以別離數(shù)KB長度的DNA,在精致 DNA片段以及染色體DNA進(jìn)展雜交時經(jīng)常使用。6沛度：瓊脂糖凝膠電泳時，不同大小 DNA片段的相對電泳遷移率在4 30c無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)展， 而當(dāng)瓊脂糖含量少于0. 5% 時，凝膠很脆弱，最好在4c下電泳以增加凝膠強(qiáng)度?！緦嶒瀮x器、材料及試劑】1、儀器和材料接種環(huán)，培養(yǎng)皿，酒精燈，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高

9、速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩器， 微量移液器及多型號槍頭，微波爐，電泳儀等菌體：E.coli DH5 a受體菌，具有Ampr標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19。Maker:X Hind III DNA Maker DL2000 DNA Maker點樣對照組：pUC19/ Hind II雙鏈線性DNA PUC19商品DNA2、實驗試劑LB培養(yǎng)基，抗生素氨葦青霉素，溶液I,溶液H,溶液田，3mol/L NaAc 溶液，預(yù)冷無水乙醇，70%乙醇溶液，RNase A母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿 /異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，TAE電泳緩沖液10X，澳化 乙錠EB）,上樣緩沖液6X。溶液 I: 50m

10、M 葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0）, 10mM EDTA（pH 8.0。（1M Tris-HCl, 12.5ml pH 8.Q 0.5M EDTA 10ml pH 8.0 ,葡萄糖 4.730g 加 ddH2O 至 500ml。在121c高壓滅菌15min ,貯存于4c ）。溶液 H : 0.2M NaOH , 1% SDS。（使用前用 10M 的 NaOH 和 10%的 SDS母液配置，防止NaOH吸收空氣中的H2O和CO2而減弱了堿性溶液田：5M醋酸鉀KAc緩沖液60ml,冰酉t酸11.5ml,重蒸水28.5ml, 溶液中濃度K+3M,Ac-5M0【實驗步驟】1、擴(kuò)增質(zhì)

11、粒菌體培養(yǎng)1在LB平板上劃線培養(yǎng)具有 Ampr標(biāo)記的E.coli DH5 a菌,37。叵溫倒置培 養(yǎng)16-18hr；之后，挑取單菌落，接種于 20ml LB液體培養(yǎng)基含Ampr80ug/ml 中，37C, 220rpm振蕩培養(yǎng)過夜12-14hq再轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)展50或100倍稀釋， 同樣37C, 220rpm振蕩培養(yǎng)4-6hr。2對50mL的離心管稱重記為m，取菌液30ml配平，6000rpm離心5min, 棄去上清液；參加5ml溶液I混勻，6000rpm離心5min,棄去上清液。取離心管 稱重記為m2),可測得菌體重量 W=m2-m1o2、提取質(zhì)粒1向離心管中參加溶液I 1.0ml/100mg

12、菌體，漩渦混勻后，冰浴5min；向離心管中參加溶液H 2.0ml/100mg菌體，輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 向離心管中參加溶液田1.5ml/100mg菌體，輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 離心管配平，12000rpm離心15min,取上清至新50ml離心管記體積為v1) 2參加2vi冰乙醇，顛倒混勻，-20C保存30min, 12000rpm離心15min,棄上清 液，將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出。向沉淀中參加5mL70%乙醇進(jìn)展 洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù)洗滌一次；37c下彳存5min,至離心管枯燥，參加1mlTE緩沖液溶解，得粗提物，將粗 提物轉(zhuǎn)移

13、至新EP管，參加100ugRNaseA 10ug/ul),將EP管放置于37c下，保溫1-2小時3、純化質(zhì)粒1將提取物等分為500ul置于EP管中，加等體積酚液，混勻后，12000r離心 5min,將上清液*$移至新EP管；參加等體積酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，混勻后， 12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)上清至新EP管；參加等體積氯仿/異戊醇混合液，混勻后， 12000rpm離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至新 EP管；2參加1/10體積的3mol/L NaAc ,混勻后，參加2倍體積包括上清液和1/10 體積的NaAc）的冰乙醇，顛倒混勻，-20C保存30min, 12000rpm離心15mi

14、n舁去 上清液；參加5mL70%乙醇進(jìn)展洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù)洗 滌一次；37c下彳存5min,至沉淀枯燥，每管參加25ul TE溶液，溫和振蕩幾秒鐘，至沉淀 溶解。將2管整合到一管，得到50ul質(zhì)粒DNA組，放置-20C下保存。4、凝膠電泳別離質(zhì)粒1制膠：1%瓊脂糖凝膠：稱取0.4g瓊脂糖于300ml三角燒瓶中，力口 40ml 1 x TAE ,微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60c左右，三角瓶放在手面可堅持1min 即可，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻 30min以上，輕 輕拔出梳子，放入電泳槽中電泳緩沖液 1XTAE，即可上樣。2取3.0 純

15、化DNA參加1.0上樣緩沖液，混合，進(jìn)展點樣。點樣完畢后， 100V, 200mA條件下電泳30min。電泳完畢后，進(jìn)展EB染色，用凝膠成像儀拍 照，得到實驗結(jié)果?！究记绊氈?、在接菌時，注意無菌操作，物品應(yīng)在酒精燈火焰上方無菌區(qū)域。將挑有菌體的接種環(huán)在三角瓶壁上輕輕接觸，然后輕輕搖動三角瓶，讓液體的 LB培養(yǎng)基輕輕沖刷菌體，當(dāng)觀察到附近的 LB培養(yǎng)基有輕微渾濁現(xiàn)象時，接菌成功，再輕輕震蕩三角瓶，使全部菌體進(jìn)入培養(yǎng)基中。2、注意離心機(jī)的使用，離心管要配平，以防錯誤操作損壞離心機(jī)。離心完 畢后，將離心管從離心機(jī)取出時應(yīng)保持其傾斜狀態(tài)，防止沉淀重新進(jìn)入上清液中。3、為獲得高純度質(zhì)粒DNA,必須徹

16、底除去雜蛋白、染色體 DNA和RNA。 在整個提取過程中出去染色體 DNA的關(guān)鍵步驟是參加溶液H、溶液田的變性和 復(fù)性環(huán)節(jié)，應(yīng)控制好變形和復(fù)興的時機(jī)。參加溶液I時，可劇烈震蕩，使菌體沉 淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時細(xì)胞尚未破裂，染色體不會斷裂；參加溶液II時， 菌液變粘稠、透明，無菌塊殘留；參加溶液田時，會立即出現(xiàn)白色沉淀。參加溶 液n和溶液田后，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在漩渦振蕩器上劇烈震蕩， 否那么，染色體DNA會斷裂成小片段，不會形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì) 粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒 DNA提純。因此，操作時一定要緩慢柔和， 采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體 DNA充分

17、作用，又不破壞染色體的 構(gòu)造。4、酚具有腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時應(yīng)小心。皮膚如不小心沾到 酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。5、沉淀DNA通常使用預(yù)冷無水乙醇，在低溫條件下長時間放置可使DNA沉淀完全。除用乙醇沉淀 DNA外，還可使用0. 6倍體積的異丙醇，但異丙醇 也能將鹽等雜質(zhì)沉淀，所以沉淀需要在常溫下進(jìn)展，并且時間不宜太長（限20min）。沉淀離心后，需用70%乙醇洗滌，以除去鹽類及揮發(fā)性較小的異丙醇。、6、在低溫下提取質(zhì)粒DNA ,收率較高。對于低拷貝治理，在收集細(xì)胞之前， 用氯霉素適當(dāng)處理，可以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。7、制備凝膠時，應(yīng)防止瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時間過長，

18、否那么溶液 將會爆沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度，可在微波爐中間歇性加熱，約沸騰三次后，至 凝膠溶解即可。同時，制膠時要將凝膠槽中的水擦拭干凈， 防止對膠的均一性產(chǎn) 生影響。8、電泳時最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳效果。如下一步實驗要 求較高，那么應(yīng)盡量使用 TAE電泳緩沖液，并且，配制瓊脂糖凝膠的電泳緩沖 液應(yīng)與電泳時使用的緩沖液為同一批配制的。9、凝膠冷卻過程中，要自然冷卻，不要用冷水沖，否那么會導(dǎo)致凝膠各局 部不均勻，對電泳結(jié)果產(chǎn)生影響1R注意上樣時要小心操作，防止損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也 不要快速擠出吸頭的樣品，防止擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。11、紫外線對眼睛和皮膚均有危害

19、性，對眼睛尤甚。為了最大限度防止受到 輻射，要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽，并應(yīng)戴好目鏡 （眼罩）或能夠有效阻擋紫外 線的全副完全罩，防止皮膚直接暴露在紫外線下。12、澳化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到 DNA或RNA分 子的堿基之間，并在300 nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn) 瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸分子。 澳化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有 毒性，使用含有這種染料的溶液時，應(yīng)戴手套進(jìn)展操作。勿將溶液滴灑在臺面或 地面上，實驗完畢后用水徹底沖洗干凈?！緦嶒灲Y(jié)果】一實驗現(xiàn)象及數(shù)據(jù)記錄1、滅菌枯燥離心管質(zhì)量:m1=15.711g菌液離心后離心管質(zhì)量：m2=15.8

20、07g；菌體質(zhì)量：W=0.0960g2、參加溶液I時，劇烈震蕩后，菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻渾濁的菌懸液，此時細(xì)胞尚未破裂，染色體不會斷裂；參加溶液R時，菌液變粘稠、透明，無菌塊殘留，翻開EP管時，可以看到粘稠的絲狀物。參加溶液田時，立即出現(xiàn)白色絮狀沉淀, 經(jīng)輕柔混勻后，沉淀漂浮在 EP管上部。3、電泳時可以明顯觀察到藍(lán)色條帶在電泳槽里由負(fù)極向正極移動，這是因為DNA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根。所以，電泳時必須注意凝膠擺放的位置，應(yīng)將點樣孔靠近負(fù)極方向擺放。二凝膠電泳結(jié)果從左至右各泳道的樣品及上樣量泳道12345121314151617樣品WHindIIIpUC19/HindIIIpUC1

21、9（商品）JD-1JD-2JD-9JD-10DNAJD-5(-)JD-7(-)DL2000樣量10.0100ng100ng3.03.03.03.06.03.03.05.0凝膠電泳觀察結(jié)果圖三結(jié)果分析1、凝膠電泳時，使用了 2種DNA Maker,分別為位于第一泳道的人/ Hind III 和位于最后一泳道的 DL2000。其中，VHind III DNA Maker可由Hindi II酶切 Lambda后得到的，本應(yīng)有8條帶，最后一條帶大小約為125bp實驗中一般很難 觀察到；DL2000 DNA Marker是由單獨的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合而成，包括6條DNA 條帶，其DNA片段相比人/Hind

22、 III DNA Maker要小，適用于比對較小的 DNA 片段。（2種Maker所含DNA條帶大小已在上圖標(biāo)記）。2、質(zhì)粒DNA提取過程中，染色體DNA、蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì)仍有局部殘 留，質(zhì)粒DNA有超螺旋、開環(huán)、線性三種不同的狀態(tài)，這些因素導(dǎo)致實驗組中 每種樣品都可以觀察到多條帶。下面以我們組JD-4為例，通過橫向比照，由 上至下對每一條帶進(jìn)展分析：1蛋白質(zhì)條帶：點樣孔附近可以觀察到其周圍有微弱熒光，說明純化后的 質(zhì)粒DNA仍含有少量蛋白質(zhì)。電泳時，由于蛋白質(zhì)分子較大，很難通過瓊脂糖分子篩，所以殘留在點樣孔處。殘留的蛋白質(zhì)經(jīng) EB染色后，在紫外下可看到熒 光，由于含量比擬少，所以熒光比擬

23、弱。2染色體DNA條帶：在點樣孔至23130bp的條帶間可以觀察到微弱的條帶， 其條帶位置同樣與14泳道的入DNA相近，該條帶代表的是殘留的染色體 DNA。 其分子量比質(zhì)粒DNA大很多，所以在瓊脂糖凝膠中移動速度較慢，條帶靠近點 樣孔。3三種構(gòu)型質(zhì)粒DNA條帶： 在4361bp至2000bp條帶間可以看到兩條 帶：上面一條顏色很淺，條帶大小在 4300bp左右，為開環(huán)DNA分子；下面一 條顏色很亮，條帶大小接近1900bp,與第三泳道的PUC19位與同一水平，為超 螺旋DNA分子。與第二泳道的pUC19/ Hindlll比照，可以推測在兩條帶間應(yīng)還 有一線性DNA分子條帶，大小接近2500bp

24、o正常情況下，由于沒有專門的限制 酶切割DNA分子，所以線性DNA分子比擬難形成。在細(xì)菌體，質(zhì)粒DNA是以負(fù)超螺旋構(gòu)型存在的。在瓊脂糖凝膠電泳中不同 構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA,盡管分子量一樣，但具有不同的電泳遷移率。其中跑在 最前沿的是共價閉合DNA ,其后依次是線性DNA和開環(huán)DNA,其原因是共價閉 合的DNA其空間位阻最小，所以跑得最快。而開環(huán) DNA空間位阻最大，所以 跑得最慢。4)RNA條帶：圖示中第15和16泳道為未加RNA酶的樣品，可見在500-100bp 圍有寬而亮的條帶，該條帶為 RNA條帶。本組中，均加過 RNA酶，RNA分解 比擬徹底，僅在100bp左右有一條很模糊的帶。四實

25、驗小結(jié)綜合以上分析，可以看出我們組JD-4)的實驗結(jié)果所得的質(zhì)粒 DNA純度還算理 想。染色體DNA和雙鏈開環(huán)DNA含量少，蛋白質(zhì)含量相對多一些。質(zhì)粒 DNA 條帶比擬亮，其亮度大約為商品PUC19的3-4倍，故可以推測，提取的質(zhì)粒DNA 濃度為PUC19濃度的3-4倍。【思考】1、質(zhì)粒提取過程中，實驗重要試劑及操作步驟的意義和作用。溶液I的作用：葡萄糖使溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子 的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。 EDTA是Cs2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，可抑制 DNase的活性，抑制微 生物的生長。Tris-Cl溶液提

26、供適當(dāng)?shù)膒H。溶液II的作用：NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer雙層膜構(gòu)造向micelle微囊 構(gòu)造的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時，強(qiáng)堿性使染色體 DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白 質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。溶液田的作用：十二烷基硫酸鈉SDS sodium dodecylsulfate遇到KAc后變成了十二烷基硫酸鉀potassium dodecylsulfate, PDS而PDS是水不溶的，因此發(fā) 生了沉淀。又SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大局部蛋白質(zhì)沉淀了，此外大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。HAc中和NaOH,因為長時間的堿性條件下會打斷基因組DNA ,只要是50100 kb大小的片斷，就沒有方法再被PDS 共沉淀了。同時變性的質(zhì)粒 DNA復(fù)性。該步反響形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了 這一沉淀。冰浴使反響更充分。冰乙醇作用：用無水乙醇沉淀DNA ,這是實驗中最常用的沉淀 DNA的方法。 乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反響，對DNA很平安，因