[精品]聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定不同蛋白質(zhì)產(chǎn)品的純度

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定不同蛋白質(zhì)產(chǎn)品的純度一、基本原理1桿陽a樣品脫內(nèi)ph小北汁1血楓綏沖膠111 nwd：小孔斥的 分閃膠內(nèi)皺o海8.3ph8 9 ph (11膠內(nèi)被敵縮p.t6.7_聚丙烯酰胺凝膠是由內(nèi)烯酰胺（簡稱act）和亞甲基雙丙烯酰胺（簡稱bis）在催化劑的作用下，聚合交 聯(lián)而成，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對樣品的分離不僅取決于各組分所帶 電荷的多少，也為分子大小有關(guān)。此外，凝膠電泳由于體系的不連續(xù)性，具有獨特的濃縮效應(yīng)，即在電泳 開始階段，山于不連續(xù)ph梯度作用，將樣品壓縮成-條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。ezz eh sii抵恢肉f不連續(xù)凝膠電沐基本

2、底理小意圖聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離效應(yīng)用凝膠電泳分離血清樣品時，除了與紙電泳一樣具有電荷效應(yīng)外，還有濃縮效應(yīng)（不連續(xù)電泳發(fā)生j： 濃縮膠屮）和分子篩效應(yīng)（發(fā)牛于分離膠?。示叻直媛时燃堧娪靖?。1、濃縮效應(yīng)當(dāng)樣品膠和濃縮膠選用ph6. 7tris/hci緩沖液、電極液選用ph& 3tris/廿氨酸緩沖液時，在電泳的 開頭，鹽酸兒乎全部解離禪放出氯離子（cd,廿氨酸（pl為6.0、pka,為2. 34, pka”為9.7）則只有 1%0. 1%解離釋放出廿氨酸根離了（nh2-ch廠c00 ）,而酸性蛋口質(zhì)一般在濃縮膠小解離為帶負電荷的離z-o 這三種離子帶有相同類型的電荷，并同吋向止極移

3、動，其有效泳動率按如下次序排列：m _ a）m . _ a）m t _ a t _clproteinprotein -肉肉式中m代表泳動率，a代表解離度，ma代表冇效泳動率。根據(jù)有效泳動率的人小區(qū)分，把最快的c稱為快離子（乂稱前導(dǎo)離子）；把最慢的 gif稱為慢離 了（又稱尾隨離了）。在電泳剛開始時，三層凝膠（樣品膠、濃縮膠和分離膠）屮都含有快離了，只是電 極緩沖液中含有慢離子。電泳進行時，山于快離子的泳動率最大，因此很快超過蛋口質(zhì)，于是在快離子后 邊形成一離子濃度低的區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)。電場強度與電導(dǎo)成反比關(guān)系：e =-（伏/厘米）7式中e代表電場強度，1代表電流強度，h代表電導(dǎo)率。因此，在低電

4、導(dǎo)區(qū)就產(chǎn)生了較高的電場強度。這種環(huán)境使蛋白質(zhì)和慢離了在快離子后血加速移動。 當(dāng)電場強度和泳動率的乘積彼此相等吋，三種離子移動速度相同（即v二me,移動速度二泳動度x電場強度）。 在快離了和慢離了移動速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立之后，則在快離子和慢離子z間形成一穩(wěn)定而乂不斷向陽 極移動的界面。也就是說在高電場強度區(qū)和低電場強度區(qū)z間形成一個迅速移動的界面。由于樣品蛋白質(zhì) 的有效泳動率恰好介于快、慢離子之間，因而它就聚集在這個移動界面的附近，并濃縮為一個狹窄的中間 層。一般樣品可濃縮300多倍。樣品被濃縮的程度與其木身濃度無關(guān)，而起決定作用的因子是氯離子的濃 度。當(dāng)氯離子濃度高時，樣品被濃縮的程度亦高。

5、2、電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)混合物在界面處被高度濃縮、堆積成層，并形成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)。但由于每種蛋白質(zhì) 分子所載的有效電荷不同，故泳動率亦不同。所以各種蛋白質(zhì)樣品經(jīng)分離膠電泳后，若樣品組分的分子量 相等。則它們就圓盤狀或帶狀按電荷順序一個一個地排列起來。3、分子篩效應(yīng)當(dāng)夾在快離子和慢離子小間的蛋口質(zhì)由濃縮膠進入分離膠時，ph值和凝膠孔徑突然改變。分離膠選用 tris/hcl緩沖液配制，其ph8.9 （電泳時實際測量是9.5）,與甘氨酸的pka”值（9. 79.8）相近。這就 致使慢離子的解離度增人，因而其有效泳動率也相應(yīng)增人。此時慢離子的冇效泳動率超過了所有-的蛋白質(zhì) 分子，從而慢離子逐漸趕上并

6、超過了所有的蛋白質(zhì)分子，隨之高電場強度消失，于是，蛋白質(zhì)樣品就在均 一的電場強度和ph條件下通過一定孔徑的分離膠。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分了量或構(gòu)型不同時，通過分離膠所受到 的摩擦力和阻滯程度就不同，最終表現(xiàn)出的泳動率也不同，這就是所說的分了篩效應(yīng)。即使蛋白質(zhì)分了的 凈電荷相似（也即自由泳動率相等），也會因分子篩效應(yīng)在分離膠中被分開。凝膠電泳又稱圓盤電泳，它的分辨率比紙電泳高得多，能檢出10°1012g樣品，特別適合于測定牛 物大分子化合物。是一種較先進的測分子量的方法。二、試劑與器材1.貯備液的配制：按下表配制a、b、c、d、e、f、g貯備液（棕色瓶裝,4°c保存）。貯備液名稱 試劑

7、、a分離膠緩沖液b濃縮膠緩沖液c分離膠貯液d濃縮膠貯液e核黃素f 蔗糖g過硫酸胺lmol / lhc148ml48mltris36. 6g5. 98gtemed0. 23ml0. 46mlacr28g10gbis0. 735g2. 5g核黃素4mg蔗糖40g過硫酸胺（ar）0. 14加重蒸水至loomlloomlloomlloomlloomlloomllooml說明調(diào)節(jié)& 9調(diào)節(jié)6.7現(xiàn)配現(xiàn)丿ij現(xiàn)配現(xiàn)川2. 0. 05%氨基黑10b （chonessnaa）溶液：用7%醋酸溶液配制。3. 染色液：0. 05%考馬斯亮藍r250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍0. 05g堿基水楊酸

8、20g加蒸謂水 至1 ooml,過濾后置試劑瓶內(nèi)保存。4. 脫色液：7%乙酸溶液。5. tris-甘氨酸電極緩沖液（ph8. 3）: tris 6. og,甘氨酸28. 8g,加蒸館水至900ml,調(diào)ph 8.3后,用重蒸水定容至loooml, 3：試劑瓶中，4c貯存，臨用前稀釋10倍。6. 0.01 %漠酚藍溶液7. 測試樣品：新鮮不溶血的人或動物血清。10%牛血請蛋白（常用ph6.5 0.01mol/l磷酸緩沖液稀釋），藻 藍蛋白制品螺旋藻sod制品& 1%瓊脂（糖）溶液：瓊脂（糖）lg,加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解,4°c貯存。9.器材：穩(wěn)壓直流電源（300-5

9、00v,電流50100ma）；圓盤電泳槽及玻璃管0.5x710cm（x;夾心式垂 直板電泳槽、凝膠模及玻璃板（135x100x1. 5mm）；燒杯（25, 50, looml各1個）；真空泵及真空干燥器; 日光燈;注射器10ml（xi）；針頭；滴管;培養(yǎng)皿直徑0120cm（x 3）；移液管lml（xi）、加l（x1）. 5ml（x 1）；移液槍（lml）o三、操作步羽（一）圓盤電泳槽的安裝、配膠、加樣與電泳1、將內(nèi)徑0. 5cm長710cm的玻管切口磨光，洗液浸泡后，水洗凈烘干，下端套上青霉素瓶塞，垂直立于實驗臺面上，并加有f液12滴。從冰箱取出各種貯液，平衡至室溫后，備用。2、分離膠的制備：

10、取一潔凈小燒杯，按a : c : h20 : e = 1 : 2 : 4.6 : 0.4（v/v）加入各 貯液，搖勻,抽氣冰泵）10min,將此膠液裝入玻管2/3高度。表面覆蓋少量蒸餡水,用日光燈照20min, 膠液凝聚后，吸去表而水分。3、濃縮膠（又稱成層膠）的制備：另取一潔凈小燒杯，按b : d : f : e=1 : 2: 4 : 1 （v/ v） 比例加入各貯液，混合后，抽氣，加到玻管中分離膠的上面，高度約1cm,表面覆蓋一層水，光照50min, 凝聚后吸公表面水分。4、拔去玻管下端橡皮塞，少量電極緩沖液輕輕沖洗凝膠底部，將裝有凝膠的玻璃管安裝在圓盤電泳 槽上槽上，插入裝有電極緩沖液的

11、電泳槽的下槽內(nèi)（保證上槽中的緩沖液不流到下槽中），下槽中裝上電 極緩沖液（保證下杷j中的緩沖液淹沒玻璃管1厘米）。5、取血清（或蛋口質(zhì)樣品）及1；液（40%蔗糖液）等體積混合，取5-10ml混合樣液沿玻管壁加在濃縮 膠的上面。再充滿緩沖液（不得冇氣泡），將凝膠玻管上端用少量緩沖液覆蓋，滴入0.01%漠酚藍指示劑。 上槽充以緩沖液，上層為陰極，下層陽極，通電，每管電流為3ma,當(dāng)指示劑進入分離膠時，電流增至每 管5ma。待指不劑移至凝膠下端1厘米時（約23小時）,切斷電源取出玻管。6、用注射器吸取蒸錨水，將針頭緊靠玻管內(nèi)壁插至凝膠與竹壁z間，慢慢注入蒸憎水，并沿管壁轉(zhuǎn) 動一周，使凝膠與管壁分離。

12、完全分離后，用洗耳球插至管口，仔細將凝膠柱擠出于培養(yǎng)皿中。7、染色與脫色將凝膠柱置于0. 05%氨基黑10 b溶液中浸染20min,然后再浸于7%醋酸溶液中脫色，至背景色脫盡。 凝膠柱亦可保存在7%醋酸液中。血清蛋白在凝膠柱上可分出十多條色帶。（二）垂肯板電泳槽的安裝、配膠、加樣與電泳1、夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏，這種電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極 槽中間夾一個凝膠模，該模由1個i叫形硅膠模板（梳子）所組成。電泳槽由上貯槽（白金電極在上或面對 短玻璃板），下貯槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠貯 液槽螺絲固定。各部i'可依

13、下列順序組裝：裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。將長、愆玻璃板 分別插到凹形硅橡框的凹形槽中。注意勿川手接觸灌膠面的玻璃。將已插好的玻璃板的凝膠模平放在上 貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。將卜貯槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式 旋緊螺絲帽。豎立電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的1 %瓊脂（糖），其冃 的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應(yīng)避免有氣泡，如圖。從冰箱取出各種貯液，平衡至室溫后，備用。2、分離膠的制備：取一潔凈小燒杯，按a : c : h20 : g = 2.5 : 5 : 2.5 : 10（v/v）加入 a、c、h20,搖勻，抽氣（水泵）1

14、0min,再加入g,輕輕混勻，立即用細長頭的滴管加將此膠液至長、短玻 璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距模板梳齒下緣約1cm,用lml注射器在凝膠表而沿短玻璃邊緣輕輕加一層重 蒸水（約34mm）,用于隔絕空氣，使膠面平瓶 為防止?jié)B漏，在上、下貯槽屮加入略低于膠面的蒸懈水。 約3060min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面冇折射率不同界面。用濾紙條吸去多余的水，但不 要碰破膠面。3、濃縮膠（又稱成層膠）的制備：另取一潔凈小燒杯，按b : d : f : e=1 : 2: 4 : 1 （v/v） 比例加入各貯液，混合后，抽氣，用細長頭的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)（即分離膠上方）, 距短玻璃

15、板上緣0. 5cm處。輕輕加入樣品杷模板。4、在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽光照射，進行光聚合，但不要造成大的升溫。在正常情況 下，照射67min,則凝膠由淡黃透明變成乳白色，表明聚合作用開始。繼續(xù)光照30min,使凝膠聚合完 全。光聚合完全后放置3060min,輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體。5、將電極槽屮的水到出，加入稀釋10倍ph& 3的tris-甘氨酸電極緩沖液，使液而淹過短玻璃板約 0. 5cm,即可樣品。6、為防止樣晶擴散，應(yīng)在樣晶中加入等體積40%蔗糖（內(nèi)含少許浪酚藍），用微量注射器取5-10 ul 上述混合液，通過緩沖液，小心將樣品加到凝

16、膠凹形樣品槽底部，待所冇凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可 開始電泳。作為分析用的page加樣量僅需幾ug, 23»l血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶。7、將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與卞杷連接，負極與上槽連接（方向切勿接錯），打開電泳儀開關(guān)，開始 時將電流調(diào)至10ma,待樣品進入分離膠時，將電流調(diào)至2030mao當(dāng)藍色染料遷移至距離橡膠框下緣lcm 時，將電流調(diào)回到零，關(guān)掉電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4°c貯存還可用3 5次。旋松固定螺絲，取岀硅橡膠松，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去，在膠板一端切除一角作為 點樣順序的標記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中。8、固定

17、、染色：本實驗釆用0. 05%考馬斯亮藍r250 （內(nèi)含20%磺基水楊酸）染色液，染色打固定同吋 進行，使染色液沒過膠板，染色30min左右。7、脫色：用7%乙酸浸泡漂洗數(shù)次，直至背景藍色褪去，如用50°c水浴或脫色搖床，則町縮短脫色吋 間。脫色液經(jīng)活性炭脫色后，可反復(fù)使丿1j。8. 制備凝膠干板：lmm以上的膠板常用凝膠真空器制備干板，如無此儀器可將脫色后的膠板浸泡在保存液中34h.制干 板時在大培養(yǎng)皿上，平放-塊干凈玻璃板（13x13cr1）,倒少許保存液在玻璃板上，使具均勻涂開，取一 張預(yù)先用蒸飾水浸透的玻璃紙平鋪在玻璃板上，趕走氣泡,小心取出凝膠板平鋪在玻璃紙上,趕走兩者 間

18、的氣泡。再取另一張蒸懈水浸透的玻璃紙覆蓋在凝膠板上，趕定氣泡，將四邊多余的玻璃紙緊緊貼于玻 璃板的背面，平放于桌上h然t燥12天，完全干后除去玻璃板，即可得到平整、透明的干膠板，此干 板可長期保存，便于定量打描。注意事項（1）制備凝膠應(yīng)選用高純度的試劑，否則會影響凝膠聚合為電泳效果。acr及bis是制備凝膠的關(guān)鍵試劑，如含丙烯酸或其他雜質(zhì)，則造成凝膠集合時間延長，聚合不均勻 或不聚合，應(yīng)將他們分別純化后方能使用。acr及bis均為神經(jīng)毒劑，対皮膚有刺激作用，實驗表明対小鼠的半致死劑量為170mg/lkg操作時應(yīng) 戴手套，純化應(yīng)在通風(fēng)櫥屮進行。acr和bis的貯液在保存過程中，由于水解作用而形成丙烯酸和nu,雖然溶液放在棕色試劑瓶中，4°c 貯存能部分防止水解，但也只能貯存12個月，可測ph （4.95.