實驗一凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)實用教案

1、實驗課要求 試劑用后及時歸位 及時記錄實驗結(jié)果 按時(nsh)完成實驗報告 離開時做好清潔工作第1頁/共30頁第一頁，共30頁。實驗報告的書寫實驗報告的書寫(shxi)標題日期一、實驗目的二、實驗原理三、操作步驟四、實驗結(jié)果( ji gu)五、分析討論第2頁/共30頁第二頁，共30頁。實驗實驗(shyn)基本操作基本操作一、玻璃儀器的洗滌二、吸量管及微量取樣器的使用(shyng)三、溶液的混勻四、離心機的使用(shyng)第3頁/共30頁第三頁，共30頁。實驗實驗(shyn)(shyn)一一 凝膠過濾層析法凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì) 1.掌握(zhngw)凝膠過濾層析法的基本原理； 2

2、.掌握(zhngw)凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)的過程。一、 實驗(shyn)目的第4頁/共30頁第四頁，共30頁。二、 實驗(shyn)原理1. 常用(chn yn)生化實驗技術(shù) 分光光度技術(shù)(jsh)電泳技術(shù)(jsh)離心技術(shù)(jsh)層析技術(shù)(jsh)第5頁/共30頁第五頁，共30頁。2. 層析技術(shù)（色譜(s p)技術(shù)） 是利用混合物中各組分(zfn)的理化性質(zhì)差異（吸附 力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親 和力等）建立起來的技術(shù)。第6頁/共30頁第六頁，共30頁。（1）層析系統(tǒng)的基本）層析系統(tǒng)的基本(jbn)組成組成 固定(gdng)相 + 流動相固體物質(zhì) / 固定(gdng)于

3、固體物質(zhì)的成分可以流動的物質(zhì)：如水和各種溶媒第7頁/共30頁第七頁，共30頁。 待分離混合物（A、B）隨流動(lidng)相通過固定相 由于理化(lhu)性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動相移動時 受到的阻滯(z zh)作用小，移動速度快分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的第8頁/共30頁第八頁，共30頁。（2 2）層析）層析(cn(cn x) x)法的分類法的分類 按兩相所處狀態(tài)(zhungti)分類 流動相流動相液體液體氣體氣體固定相固定相液體液體液液液層析法液

4、層析法氣氣液層析法液層析法固體固體液液 固層析法固層析法氣氣 固層析法固層析法第9頁/共30頁第九頁，共30頁。 按層析原理分類(fn li) 名稱名稱原理原理吸附層析法吸附層析法 固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力不同而分離劑表面吸附能力不同而分離分配層析法分配層析法 各組分在流動相和固相中的分配系數(shù)不同各組分在流動相和固相中的分配系數(shù)不同離子交換層離子交換層析法析法固定相是離子交換劑，各組分與離子交換固定相是離子交換劑，各組分與離子交換劑親和力不同而分離劑親和力不同而分離親和層析法親和層析法 固定相只能與一種待分離組分專一結(jié)合，固定相只能

5、與一種待分離組分專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組分分離以此和無親和力的其它組分分離凝膠層析法凝膠層析法 固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同第10頁/共30頁第十頁，共30頁。 按操作形式不同(b tn)分類 名稱名稱操作形式操作形式柱層析法柱層析法固定相裝于層析柱內(nèi)，使樣品沿著一個方固定相裝于層析柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達分離的層析法，包括一般柱層向前移而達分離的層析法，包括一般柱層析法、毛細管層析法和微粒填充柱層析法析法、毛細管層析法和微粒填充柱層析法平面層析法平面層析法層析過程在固定

6、相構(gòu)成的平面層內(nèi)進行的層析過程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進行的層析法，包括紙層析法、薄層層析法和薄層析法，包括紙層析法、薄層層析法和薄膜層析法膜層析法第11頁/共30頁第十一頁，共30頁。（3 3）層析技術(shù)的優(yōu)點）層析技術(shù)的優(yōu)點(yudin)(yudin) 分離效率高 分析(fnx)速度快 具有極高的靈敏度 應用范圍廣適用(shyng)： 雜質(zhì)多、含量少的復雜樣品分析，尤其適用(shyng)于生物樣品的分離分析第12頁/共30頁第十二頁，共30頁。3. 凝膠過濾(gul)層析法（gel filtration chromatography） （1）原理： 根據(jù)(gnj)分子大小的差別進行分離。每個凝

7、膠顆 粒好象一個篩子，小分子物質(zhì)可以進入顆粒內(nèi)部， 大分子物質(zhì)被排阻在外。 又名分子篩過濾(gul)，排阻層析第13頁/共30頁第十三頁，共30頁。第14頁/共30頁第十四頁，共30頁。（2 2）凝膠的特點）凝膠的特點(tdin)(tdin) 屬于惰性(duxng)載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條 件較溫和，可在相當廣的溫度范圍內(nèi)進行，不需要 有機溶劑，對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。 交聯(lián)葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠第15頁/共30頁第十五頁，共30頁。（3 3）凝膠的選擇）凝膠的選擇(xunz)(xunz)A.葡聚糖凝膠 (商品(shngpn)名: Sephadex，Dextra

8、n)B. 型號: G-10 G-200多孔網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)(jigu)數(shù)字愈小,交聯(lián)度越大,被篩分物質(zhì)的分子量也愈小吸水能力，每g干膠吸水量的10倍第16頁/共30頁第十六頁，共30頁。 Sephadex G-50： 對多肽(du ti)及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 1500 30000 Sephadex G-200： 對多肽(du ti)及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 5000 80000例：第17頁/共30頁第十七頁，共30頁。 B. 瓊脂糖凝膠 ( 商品名: Sepharose , Bio- gel A ) 對實驗條件要求高 ( 溫度, pH ) 40 4.5- 9.0 工作的下限(xix

9、in)是葡聚糖凝膠工作的上限, 用于大分子物質(zhì)的分離第18頁/共30頁第十八頁，共30頁。 C. 聚丙烯酰胺凝膠 商品(shngpn)名: Bio gel P（生物膠P）第19頁/共30頁第十九頁，共30頁。三、實驗(shyn)操作 1. 柱的選擇 直徑： 15 cm 一般(ybn)長度：直徑 = 10：1 20：1 本實驗玻柱： 直徑0.8 1.5cm 長度 17 20cm第20頁/共30頁第二十頁，共30頁。2. 凝膠選擇(xunz)、制備 血紅蛋白 溶菌酶 分離(fnl) （64500） （11400） 選擇 Sephadex G-50Sephadex G-50： 對多肽(du ti)及

10、蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 1500 30000第21頁/共30頁第二十一頁，共30頁。 制備： 將干膠顆粒懸浮于5 10倍的蒸餾水或洗脫液中 充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉(qngxi)出去第22頁/共30頁第二十二頁，共30頁。3. 凝膠裝柱 柱固定于架子(ji zi)上，垂直放置，關(guān)住出口 自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使G-50 開始下沉， 至1 2cm時，打開出口 凝膠逐層上升，至頂部 2-3cm時，關(guān)閉出口第23頁/共30頁第二十三頁，共30頁。注意(zh y)點： 垂直(chuzh)放置 防止氣泡產(chǎn)生 防止柱的分層第24頁/共30頁第二十四頁，共30頁。4. 平衡(pngh

11、ng) 放置(fngzh)一段時間，約40分鐘（使凝膠更好的壓實）注意(zh y)：防止床面干涸，可適當補充蒸餾水第25頁/共30頁第二十五頁，共30頁。5. 加樣 加樣前打開出口，使床面的蒸餾水流出，正好露 出床面時，立即關(guān)閉出口（將干未干） 用滴管將混合樣品(0.6ml，即血紅蛋白和溶菌酶 各0.3ml)緩緩沿柱內(nèi)壁小心(xio xn)加于床表面 打開出口，使樣品進入床內(nèi)，直到床面重新露出, 立即加入12倍于樣品體積的蒸餾水第26頁/共30頁第二十六頁，共30頁。6. 洗脫(x tu)當此少量蒸餾水接近流干時，反復多次加入蒸 餾水，進行洗脫，直到兩帶分開檢查(jinch)Hb在層析床中色帶位置，待Hb洗脫完后， 用試管分步收集洗脫液 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d 檢查(jinch)溶菌酶洗脫情況，若為紫色，則為（+）第27頁/共30頁第二十七頁，共30頁。C Cu uS SO O4 4H2N - C - NH - C - NH2OO紫紫 紅紅色色堿堿性性縮二脲反應(fnyng)