現(xiàn)代微生物學(xué)實驗技術(shù)課程論文

1、現(xiàn)代微生物學(xué)實驗技術(shù)課程論文實驗一、耐高鹽菌的分離與純化1、 實驗?zāi)康?、認(rèn)識并了解土壤微生物物種的多樣性；2、分離純化土壤環(huán)境中耐鹽的菌株。2、 實驗方法2.1 實驗器材與試劑恒溫振蕩培養(yǎng)箱；顯微鏡；超凈臺；滅菌鍋；錐形瓶；培養(yǎng)皿；結(jié)晶紫染色液；液體培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L；固體培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂條20g/L；2.2 實驗步驟2.2.1土壤的制備：選擇高鹽的土壤區(qū)域，去表層土，挖5-20cm深度的土壤數(shù)10g，裝入已滅菌的牛皮紙袋。2.2.2培養(yǎng)基的配制與滅菌：液體培養(yǎng)基200ml，分裝為4瓶，每瓶50ml，固體培養(yǎng)基100ml。滅菌： 121&#

2、176;C，20min，高壓蒸汽滅菌。滅完菌后取出，兩瓶50ml的液體培養(yǎng)基中各加入15%的NaCl，另外兩瓶50ml的液體培養(yǎng)基中各加入5%的NaCl，混勻。同時將固體培養(yǎng)基取出倒平板。2.2.3耐鹽微生物的富集：分別在NaCl濃度為5%，15%的50mL 液體培養(yǎng)基中加入相同量5g的土壤，28、150r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)富集4天后，從富集一代的培養(yǎng)液中吸取5%的菌液到新的NaCl濃度為5%，15%的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)富集培養(yǎng)3天。2.2.4耐鹽微生物的分離純化：取NaCl濃度為5%，15%富集培養(yǎng)的培養(yǎng)物鏡檢（結(jié)晶紫染色），發(fā)現(xiàn)NaCl為5%的濃度下的菌更密集，挑取該濃度的菌液，進(jìn)行劃線

3、分離，得到純培養(yǎng)物后再挑取兩種不同的菌落再次劃線分離，從而得到單菌落。3、 實驗結(jié)果通過對高鹽土壤中微生物的富集及分離純化，得到如下圖兩株菌株，命名為L-1、L-2。菌株L-1產(chǎn)黃色色素，菌落呈黃色，圓形，表面光滑，邊緣整齊，菌株L-2產(chǎn)橘紅色色素，菌落呈橘紅色，圓形，表面光滑，邊緣不整齊。 實驗二 、耐鹽菌的形態(tài)學(xué)及生理生化反應(yīng)1、實驗?zāi)康?、從形態(tài)學(xué)特點對耐鹽菌株進(jìn)行初步鑒定；2、對耐鹽菌株進(jìn)行生理生化實驗，進(jìn)一步鑒定菌株。2、實驗原理形態(tài)學(xué)鑒定是菌種鑒定中最簡單、最初步也是最直觀的鑒定方法。包括可以通過肉眼觀察菌落特征、顯微鏡觀察菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及革蘭氏染色等方法，都是形態(tài)學(xué)鑒定中比較常用

4、的方法。微生物細(xì)胞在酶的催化下進(jìn)行各種各樣的生理生化反應(yīng)。把微生物細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)，通過觀察生理現(xiàn)象和檢查代謝產(chǎn)物，可以了解微生物的代謝過程和特點。由于不同微生物可能具有不同的酶，代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能也有所不同，生理生化反應(yīng)是微生物鑒定分類鑒定的重要指標(biāo)之一。糖發(fā)酵實驗：微生物具有不同的利用各種碳源的能力，其原理在于不同微生物具有不同的酶系。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源，但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大差異。有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、甲烷、二氧化碳等），有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。石蕊牛乳試驗：石蕊是在中性時呈粉紅色；堿性是呈藍(lán)色；還原時，則

5、自下而上使牛奶褪色還原成白色。乳酸細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，石蕊變紅，當(dāng)酸度很高時，可使牛奶凝固。如試驗菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，則使牛奶變得較澄清略透明，表明牛奶已胨化。3、實驗方法3.1 實驗器材與試劑恒溫培養(yǎng)箱；顯微鏡；超凈臺；滅菌鍋；試管；0.6%Agar半固體培養(yǎng)基；革蘭氏染色試劑；LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g，NaCl 10g/L；糖發(fā)酵試驗小管；石蕊牛乳實驗試管培養(yǎng)基；菌株L-1、L-2、E.C、B.S3.2 實驗步驟3.2.1對數(shù)期菌液的制備：分別挑取菌株L-1、L-2的單菌落接種于3ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。3.2.2革蘭

6、氏染色：將菌株L-1、L-2分別涂片-固定-2%結(jié)晶紫1min，水洗擦干-碘液 1min，水洗擦干-95%乙醇洗脫25s-水洗擦干-復(fù)紅染色1min-水洗擦干-鏡檢(分別用E.C和B.S做對照)3.2.3游動性檢測：將L-1、L-2分別用接種針穿刺接種至0.6%Agar半固體培養(yǎng)基(B.S做對照)，37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。3.2.4生理生化反應(yīng)： 糖發(fā)酵試驗（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）：用接種環(huán)分別挑取第二次劃線分離的菌落L-1、L-2，接種于糖發(fā)酵裝置小管中，并分別接種E.C和B.S做為對照實驗，接種后裝置小管倒置，37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2d后觀察結(jié)果。石蕊牛乳實驗（利用蛋白質(zhì)酪素的能力

7、）：分別在石蕊牛乳培養(yǎng)基中接種耐鹽菌株L-1、L-2、E.C和B.S，放置于37恒溫培養(yǎng)箱，兩周時間左右觀察結(jié)果。3.2.5芽孢的觀察：分別挑取菌落L-1、L-2中心菌體（要的是劃線分離已生長3-4天的平板）-涂片固定-鏡檢(對照B.S)（注：芽孢為不著色、透明中空、圓形或橢圓形）3.2.6莢膜的觀察：直接觀察菌落4、 實驗結(jié)果通過一系列的生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)菌株L-1為革蘭氏陽性的球菌，具有鞭毛，無芽孢也無莢膜，能利用葡萄糖產(chǎn)氣，菌株L-2也為革蘭氏陽性的桿菌，具有鞭毛，無芽孢也無莢膜，能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，結(jié)果如下表：菌株實驗過程L-1L-2E.CB.SG+染色結(jié)果G+，球菌G+，桿菌G-，桿

8、菌G+，桿菌鞭毛有有有有芽孢無無無有莢膜無無無無石蕊牛乳實驗無胨化現(xiàn)象，不變色無胨化現(xiàn)象，不變色不胨化，變藍(lán)胨化，變紅葡萄糖不產(chǎn)酸，產(chǎn)氣產(chǎn)酸，產(chǎn)氣產(chǎn)酸，產(chǎn)氣產(chǎn)酸，產(chǎn)氣蔗糖不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣產(chǎn)酸，產(chǎn)氣不產(chǎn)酸，產(chǎn)氣乳糖不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣不產(chǎn)酸，產(chǎn)氣實驗三、耐鹽菌的相關(guān)遺傳學(xué)實驗1、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)和掌握高鹽溶解法制備細(xì)菌基因組DNA的原理、方法和技術(shù)。2、學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌16S rRNA 序列擴(kuò)增，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)菌菌種鑒定的方法。3、學(xué)習(xí)16SrRNA序列的TA克隆鑒定菌種的原理和方法。4、學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)座子側(cè)翼基因序列的克隆鑒定菌種的方法。2、實驗原理1、高鹽溶解法制備細(xì)菌基因

9、組DNA：本方法通過溶菌酶破除細(xì)胞壁，SDS裂解細(xì)胞，蛋白酶降解蛋白的方法使DNA和蛋白分離出來，根據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的NaCl溶液中的溶解度不同進(jìn)行分離，然后用蛋白質(zhì)變性沉淀劑去除蛋白，使核酸釋放出來，再利用核酸不溶于乙醇的性質(zhì)將核酸析出，達(dá)到分離提純的目的。2、細(xì)菌16S rRNA 序列擴(kuò)增：16S rRNA是細(xì)菌體內(nèi)普遍存在的一種核糖體RNA，它在功能上具有高度穩(wěn)定性，同一種屬的細(xì)菌其16S RNA基因序列差異很小，遺傳較為穩(wěn)定，長度在1550±200bp左右，代表信息量適中，是研究系統(tǒng)進(jìn)化的好材料。3、TA克?。簆MD 19-T Vector是一種高效克隆

10、PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。本載體由pUC19載體改建而成，在pUC19載體的多克隆位點處的Xba I 和Sal I 識別位點之間插入了EcoR V 識別位點，用EcoR V 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加 “T” 而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時都有在PCR 產(chǎn)物的3末端添加一個“A” 的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。4、轉(zhuǎn)座子側(cè)翼基因序列的克?。恨D(zhuǎn)座子是染色體上一段可移動的DNA片段，它可從染色體的一個位置跳到另一個位置。當(dāng)轉(zhuǎn)座子跳躍而插入到某個功能基因時，就會引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型，而當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切

11、離這一位點時，失活基因的功能又可得一恢復(fù)。遺傳分析可確定某基因的突變是否由轉(zhuǎn)座子引起。由轉(zhuǎn)座子引起的突變便可以轉(zhuǎn)座子DNA為探針，從突變株的基因組文庫中釣出含該轉(zhuǎn)座子的DNA片段，并獲得含有部分突變株DNA序列的克隆，進(jìn)而以該DNA為探針，篩選野生型的基因組文庫，最終得到完整的基因。3、實驗方法3.1對數(shù)期菌液的制備：分別挑取菌株L-1、L-2的單菌落接種于3ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。3.2高鹽溶解法制備細(xì)菌基因組DNA：分別取L-1、L-2的菌懸液1ml于滅菌的1.5ml 的Eppendorf離心管中，12000rpm離心1min。倒去上清，回收菌

12、體，加入1ml的ddH2O懸浮洗滌，12000rpm離心1min。再重復(fù)上述步驟的操作過程2次。菌體沉淀用270l TE緩沖液懸浮，加入15l 溶菌酶，混勻，37水浴作用15min。加入15l 10%SDS混勻，再加入10l蛋白酶，輕柔混勻，37水浴1小時，或觀察到混合液變清亮止。加入200l 5M NaCl（4保存）劇烈振蕩后，加入500l 25：24：1的酚：氯仿：異戊醇劇烈振蕩混勻。10000rpm離心10min，取上層液體至1.5ml Eppendorf離心管中。重復(fù)以上過程1-2次，直至中間蛋白層不明顯。取上層液體后，加入400l TE后加入500l異丙醇沉淀，置于-70 10min

13、。10000rpm離心10min，沉淀用70%預(yù)冷的乙醇洗兩次，自然吹干后，用50l ddH2O溶解。吸取5l 提取所得的DNA溶液，于1瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳并分析結(jié)果。3.3細(xì)菌16S rRNA 序列擴(kuò)增：在滅菌的PCR管中按以下次序分別加入（100l反應(yīng)體系, 加完樣后，分成50ulx 2管）：ddH2O：80ul，10×PCR緩沖液：1ul，dNTP（20mmol/L）：5ul，MgCl2（25mM）：8ul，引物1：2ul，引物2(20mol/L)：2ul，DNA模板：2ul，Taq酶(175U/(ul)：1ul。依次加入以上樣品后，于臺式離心機上低速離心2-3s，以混合所有

14、試劑材料。將加樣完畢的PCR管放置于PCR擴(kuò)增儀的槽孔中，設(shè)立以下程序運行，進(jìn)行目的DNA基因的擴(kuò)增。反應(yīng)完后，94°C 5min94°C 1min52°C 1min 30 cycle72°C 1.5min72°C 5min4°C forever吸取2l PCR反應(yīng)液，于1瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳并分析結(jié)果。電泳確定條帶后，送50uL PCR樣品測序，附帶測序引物16S-F/R（20uM）。3.4細(xì)菌基因組DNA酶切：將提取所得的L-1、L-2菌株的基因組DNA按以下體系（DNA：5ul，10×buffer：10ul，酶：1ul

15、，ddH2O：84ul）反應(yīng)2h，4h，過夜，其中酶分別為EcoR I和Kpn I。反應(yīng)完后，每次取30ul反應(yīng)液加入10ul Loading buffer，于1瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳并分析結(jié)果。3.5 TA克?。?、酶連：50ul PCR產(chǎn)物用ddH2O補足至100ul，加入1/10V NH4Ac，10000rpm，5min,吸取上清，加入3V 無水乙醇，-70°C, 靜置10min，10000rpm，離心10min，加入1ml 70%乙醇，洗2次，最后一次進(jìn)行10000rpm，1min離心，槍頭吸去殘留的酒精，置于超凈臺風(fēng)口吹干，加入15ul ddH2O 溶解。再以以下體系（ T4

16、 DNA ligase buffer(10 X)：2ul，T4 DNA ligase(5-10U/ul)：1ul，PCR fragment： 5ul，pUM19- T vector ：1ul，ddH2O：11ul），酶連過夜。2、電轉(zhuǎn)化：10ul上述酶連產(chǎn)物加入1管感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，冰上放置1min，加入至電擊杯中，1.1kV，電擊，再將電擊后反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至1ml LB medium中，37度，培養(yǎng)50min，再將菌液離心，倒部分上清至終體積約100ul，涂布Amp100,X-gal 50 的平板中，37°C培養(yǎng)16h。3.6 轉(zhuǎn)座子側(cè)翼基因序列的克隆鑒定：1、篩選鏈霉素抗性突變

17、菌株：制備以下6種（大觀霉素：Spe、卡那霉素：Km、鏈霉素：Str、四環(huán)素：TC、克林霉素：CM、慶大霉素：GM）抗性的LB固體平板，將菌株L-1、L-2分別涂布于制備的抗性平板上，37°C倒置培養(yǎng)16h，觀察兩株菌的抗性。2、接合：通過對L-1、L-2抗性的研究發(fā)現(xiàn)菌株L-1具有Spe、Km、Str、TC的抗性，但不具有CM的抗性，而L-2什么抗性都不具有，所以選擇接合的供體菌PJZ260StrsCMR,分別吸取供體菌PJZ260StrsCMR和受體菌L-1的菌液1ml于兩個滅過菌的離心管中，10000rpm，離心2min，倒掉上清液，加入1mlddH2O洗兩次，加入100uld

18、dH2O溶解，得到菌液。3、涂布檢測接合結(jié)果：取500ul供體菌和500ul受體菌混勻，制備具有鏈霉素Str、克林霉素CM兩種抗性的LB固體平板4個，取1個平板分成3區(qū)，加3個濾紙片，一個加入20ul供體菌D，一個加入20ul受體菌R，一個加入混合菌20ulD+R，37°C倒置培養(yǎng)16h，再將濾紙片取出，用100ul的無菌水洗滌，分別涂布于3個抗性平板上，37°C倒置培養(yǎng)16h，觀察結(jié)果。4、實驗結(jié)果4.1細(xì)菌基因組DNA、細(xì)菌基因組DNA酶切電泳結(jié)果如下圖：1：DNA Marker DL3000；2：菌株L-1基因組DNA；3：菌株L-2基因組DNA；4-6：菌株L-1基

19、因組DNA酶切（ EcoR I）2h、4h、過夜；7-8：菌株L-1基因組DNA酶切（ Kpu I）2h、4h、過夜；10-12：菌株L-2基因組DNA酶切（ EcoR I）2h、4h、過夜；13-15：菌株L-2基因組DNA酶切（ Kpn I）2h、4h、過夜4.2細(xì)菌16S rRNA 序列擴(kuò)增電泳結(jié)果如下圖： 1：DNA Marker DL2000； 2：菌株L-1 ；3：菌株L-24.3 細(xì)菌16S rRNA測序結(jié)果： 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測序，菌株L-1測序成功，菌株L-2不合格，菌株L-1測序結(jié)果如下：GAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT

20、AACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGGGGTGCTTGCACCCCGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCATAGGAATCTGCCCGATAGTGGGGGATAACCTGGGGAAACCCAGGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGGGGGCTTCGGCTCCCGCTATCGGATGAGCCTATGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATCGGGACTGAGACACGGCCCGAACTCCTACGGGAGGCAGCAG

21、TGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCCTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGAGGAAGAACGCCTGGTGGTTAATACCCATCAGGAAAGACATCACTCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGCTTGATAAGCCGGTTGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCCGGAACTGTCAAGCTAGAGT

22、GCAGGAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGACTGACACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACCAGCCGTTGGGTGCCTAGCGCACTTTGTGGCGAAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT

23、AATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCTGCGAATTGGTAGAGATACCTTAGTGCCTTCGGGAACGCAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTT

24、GCCAACTCGCGAGAGTGAGCCAATCCCGAAAAGCCGATCTCAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGGTTAGCCTAACGCAAGAGGGCGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC Halomonas_hamiltonii_strain_W1025(NR_115089.1) H

25、alomonas_stevensii_strain_S18214(NR_115088.1) L-1 Halomonas_johnsoniae_strain_T68687(NR_115090.1) Halomonas_aquamarina_strain_DSM_30161(NR_042063.1) Halomonas_meridiana_strain_DSM_5425(NR_042066.1) Halomonas_venusta_strain_DSM_4743(NR_042069.1) Halomonas_gomseomensis_strain_M12(NR_042488.1) Halomona

26、s_nanhaiensis_strain_YIM_M_13059(NR_118488.1) Halomonas_titanicae_BH1(NR_117300.1) Kushneria_indalinina_strain_CG2.1(NR_115092.1) Salinicola_halophilus_strain_CG4.1(NR_042125.1) Chromohalobacter_marismortui_strain_NBRC_103155(NR_114222.1) Modicisalibacter_tunisiensis_strain_LIT2(NR_043909.1) Cobetia_marina_