食品中乳酸菌的檢測(cè)

1、-作者xxxx-日期xxxx食品中乳酸菌的檢測(cè)【精品文檔】1  范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。2  規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3  術(shù)語(yǔ)和定義3.1  乳酸菌 lactic acid bacteria    一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通

2、稱。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）。4  設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：4.1  恒溫培養(yǎng)箱：36 ±1 。4.2  冰箱：2 5 。4.3  均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。4.4  天平：感量0.1 g。4.5  無(wú)菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。4.6  無(wú)菌

3、吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。4.7  無(wú)菌錐形瓶：500 mL、250 mL。5  培養(yǎng)基和試劑5.1  MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良MRS培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.1。5.2  MC培養(yǎng)基（Modified Chalmers 培養(yǎng)基）：見(jiàn)附錄A中A.2。5.3  0.5%蔗糖發(fā)酵管:見(jiàn)附錄A中A.3。5.4  0.5%纖維二糖發(fā)酵管:見(jiàn)附錄A中A.3。5.5 

4、0;0.5%麥芽糖發(fā)酵管:見(jiàn)附錄A中A.3。5.6  0.5%甘露醇發(fā)酵管:見(jiàn)附錄A中A.3。5.7  0.5%水楊苷發(fā)酵管:見(jiàn)附錄A中A.3。5.8  0.5%山梨醇發(fā)酵管:見(jiàn)附錄A中A.3。5.9  0.5%乳糖發(fā)酵管:見(jiàn)附錄A中A.3。5.11 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中A.5。 莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學(xué)純。5.13 半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）：純度99%。6  檢驗(yàn)程序乳酸菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。 7  操作步驟7.1.1  樣

5、品的全部制備過(guò)程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序。7.1.2  冷凍樣品可先使其在2 5 條件下解凍，時(shí)間不超過(guò)18 h，也可在溫度不超過(guò)45 的條件解凍，時(shí)間不超過(guò)15 min。7.1.3  固體和半固體食品：以無(wú)菌操作稱取25 g樣品，置于裝有225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000 r/min10000 r/min均質(zhì)1 min2 min，制成1:10樣品勻液；或置于225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min制成1:10的樣品勻液。7.1.4  液體樣品：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無(wú)菌吸管吸取樣品25

6、 mL放入裝有225 mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。7.2  步驟7.2.1  用1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。7.2.2  另取1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。7.2.3  乳酸菌計(jì)數(shù)7.2.3.1  乳酸菌總數(shù)根

7、據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。36±1厭氧培養(yǎng)48 h±2 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min內(nèi)完成。7.2.3.2  雙歧桿菌計(jì)數(shù)    根據(jù)對(duì)待檢樣品雙歧桿菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽

8、的MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均。36±1厭氧培養(yǎng)48 h±2 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。7.2.3.3  嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。36±1需氧培養(yǎng)48 h±2 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm&

9、#177;1 mm， 菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。7.2.3.4  乳桿菌計(jì)數(shù)    7.2.3.1 項(xiàng)乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去7.2.3.2 項(xiàng)雙歧桿菌與7.2.3.3 項(xiàng)嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計(jì)數(shù)。7.3  菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。7.3.1  選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板

10、計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。7.3.2  其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。7.3.3  當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。7.4  結(jié)果的表述7.4.1  若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再

11、將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。7.4.2  若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：  式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。 7.4.3  若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.4  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均

12、小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.5  若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.6  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU時(shí)，則以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.5  菌落數(shù)的報(bào)告7.5.1  菌落數(shù)小于100 CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。7.5

13、.2  菌落數(shù)大于或等于100 CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。7.5.3  稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。8  結(jié)果與報(bào)告根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果出具報(bào)告，報(bào)告單位以CFU/g（mL）表示。9  乳酸菌的鑒定（可選做）9.1  純培養(yǎng)挑取3個(gè)或以上單個(gè)菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板，置36 ±1 厭氧培養(yǎng)48 h。 

14、;9.2  鑒定9.2.1  雙歧桿菌的鑒定按GB 4789.34的規(guī)定操作。9.2.2  涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長(zhǎng)桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無(wú)芽胞，革蘭氏染色陽(yáng)性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑為0.5 m2.0 m，成對(duì)或成鏈排列，無(wú)芽胞，革蘭氏染色陽(yáng)性。9.2.3  乳酸菌菌種主要生化反應(yīng)見(jiàn)表1和表2。  附  錄 A  培養(yǎng)基及試劑A.1  MRS培養(yǎng)基A.1.1  成分蛋白胨10.0 g牛肉粉

15、5.0 g酵母粉4.0 g葡萄糖20.0 g吐溫801.0 mLK2HPO4·7H2O2.0 g醋酸鈉·3H2O5.0 g檸檬酸三銨2.0 gMgSO4·7H2O0.2 gMnSO4·4H2O0.05 g瓊脂粉15.0 gA.1.2  制法將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121 高壓滅菌15 min20 min。A.1.3  莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基A.1.3.1  莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液制備：稱取50mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，

16、用0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾除菌。A.1.3.2  半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備：稱取250mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，用0.22 mm微孔濾膜過(guò)濾除菌。A.1.3.2  制法將A.1.1 成分加入到950 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121 高壓滅菌15 min20 min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至48 ，用帶有0.22 mm微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液及半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備加入到熔化瓊脂中，使培養(yǎng)基中莫匹羅星鋰鹽的濃度為50 mg/mL，半

17、胱氨酸鹽酸鹽的濃度為500 mg/mL。A.2  MC培養(yǎng)基A.2.1  成分大豆蛋白胨           5.0 g牛肉粉3.0 g酵母粉3.0 g葡萄糖20.0 g乳糖                        

18、0;20.0 g碳酸鈣10.0 g瓊脂15.0 g蒸餾水1 000 mL1中性紅溶液5.0 mL A.2.2  制法將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，加入中性紅溶液。分裝后121 高壓滅菌15 min20 min。A.3  乳酸桿菌糖發(fā)酵管A.3.1  基礎(chǔ)成分牛肉膏5.0 g蛋白胨5.0 g酵母浸膏5.0 g吐溫800.5 mL瓊脂1.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4 mL蒸餾水1 000 mLA.3.2  制法按0.5%加入所需糖類，并分裝小試管,121 高壓滅菌15 min20 min。A.4.1 成分 蛋白胨5.0 g磷酸氫二鉀1.0 g七葉苷3.0 g枸櫞酸鐵0.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4 mL蒸餾水100 mLA