基因工程原理試題1(1)

1、基因工程原理練習(xí)題及其答案一、填空題1 基因工程是70年代發(fā)展起來(lái)的遺傳學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科。2 基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)是： (1)分子水平上的操作，(2)細(xì)胞水平上的表達(dá)3 基因克隆中三個(gè)基本要點(diǎn)是：克隆基因的類(lèi)型；受體的選擇；載體的選擇4 通過(guò)比較用不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小 的片段，可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的限制性酶切圖譜。5 限制性內(nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個(gè)大寫(xiě)字母取自屬名的第一個(gè)字母，第二、三兩個(gè)字母取自_種名的前兩個(gè)字母，第四個(gè)字母則用株名表示。6部分酶切可采取的措施有：(1)減少酶量；(2)縮短反應(yīng)時(shí)

2、間；(3)增大反應(yīng)體積等。7第一個(gè)分離的限制性內(nèi)切核酸酶是EcoK；而第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性內(nèi)切核酸酶是_ EcoRl。8限制性內(nèi)切核酸酶BsuRI和Hae的來(lái)源不同，但識(shí)別的序列都是GGCC，它們屬于異源同工酶。9DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_枯草桿菌蛋白酶切割DNA聚合酶I得到的分子量為76kDa的大片段，具有兩種酶活性： (1) 5'-3'合成酶的活性； (2) 3'-5'外切核酸酶的活性。10為了防止DNA的自身環(huán)化，可用堿性磷酸酶去雙鏈DNA_5端的磷酸基團(tuán)。11EGTA是_Ca2+_離子螯合劑。12測(cè)序酶是修飾了的T7 DNA聚合酶，

3、它只有_ 5'-3'合成酶的活性，而沒(méi)有3'-5'外切酶的活性。13切口移位(nick translation)法標(biāo)記DNA的基本原理在于利用DNA聚合酶I的_5'一3'外切核酸酶和5'一3'合成酶的作用。14欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)變成平末端的雙鏈形式，通?？刹捎胈 S1核酸酶切割或DNA聚合酶補(bǔ)平。15反轉(zhuǎn)錄酶除了催化DNA的合成外，還具有_核酸水解酶H的作用，可以將DNA- RNA雜種雙鏈中的_RNA_水解掉。16基因工程中有3種主要類(lèi)型的載體：質(zhì)粒DNA，病毒DNA，質(zhì)粒和病毒DNA雜合體。17就克隆一個(gè)

4、基因(DNA片段)來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體也必需包括三個(gè)部分：_復(fù)制區(qū)： 含有復(fù)制起點(diǎn)；選擇標(biāo)記： 主要是抗性基因；克隆位點(diǎn)： 便于外源DNA的插入。另外，一個(gè)理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子量。 18 一個(gè)帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在有EB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后，一部分細(xì)胞中已測(cè) 質(zhì)粒消除(或治愈) 。19 pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，它的復(fù)制子來(lái) 不出質(zhì)粒，這種現(xiàn)象叫源于pMBl ，它的四環(huán)素抗性基 因來(lái)自于pSCl01，它的氨芐青霉素抗性基因來(lái)自于pSF2124(R質(zhì)粒)。20YAC的最大容載能力是1000kb，BAC載體的最大容載能力是 300kb 。21pSCl01是一種 嚴(yán)緊 復(fù)制的質(zhì)粒。22

5、pUCl8質(zhì)粒是目前使用較為廣泛的載體。pUC系列的載體是通過(guò)pBR322和M13 兩種質(zhì)粒改造而來(lái)。它的復(fù)制子來(lái)自 pMBl ，Amp 抗性基因則是來(lái)自 轉(zhuǎn)座子。23噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是它在細(xì)菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNA的擴(kuò)增； 二是對(duì)某些噬菌體(如l噬菌)的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究得比較清楚，其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳也研究得比較詳盡。24 野生型的M13不適合用作基因工程載體，主要原因是沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)和 選擇標(biāo)記。25 黏粒(cosmid)是質(zhì)粒噬菌體雜合載體，它的復(fù)制子來(lái)自質(zhì)粒、COS位點(diǎn)序列來(lái)自 l噬菌體，最大的克隆片段達(dá)到4

6、5 kb。26 野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是：(1) 分子量大，(2)酶的多切點(diǎn)，(3)無(wú)選擇標(biāo)記27噬菌粒是由質(zhì)粒和噬菌體DNA共同構(gòu)成的，其中來(lái)自質(zhì)粒的主要結(jié)構(gòu)是復(fù)制區(qū)，而來(lái)自噬菌體的主要結(jié)構(gòu)是 IG區(qū) 。28l噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，總的長(zhǎng)度應(yīng)在噬菌體基 因組的 75105 的范圍內(nèi)。29 在分離DNA時(shí)要使用金屬離子螯合劑，如EDTA和檸檬酸鈉等，其目的是螯合Mg2+離子，抑制核酸酶的活性 。30 用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在DNA溶液中加人單價(jià)的陽(yáng)離子，如NaCl和NaAc，其目的是中和DNA分子的負(fù)電荷，增加DNA分子間的凝聚力。3

7、1 引物在基因工程中至少有4個(gè)方面的用途：(1)合成探針；(2)合成cDNA；(3)用于PCR反應(yīng)；(4)進(jìn)行序列分析32Clark發(fā)現(xiàn)用Taq DNA聚合酶得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物不是平末端，而是有一個(gè)突出 堿基末端的雙鏈DNA分子。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)了克隆PCR產(chǎn)物的T載體。33在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 第二鏈合成時(shí)形成的發(fā)夾環(huán) 34乙醇沉淀DNA的原理是乙醇使DNA分子脫水。35 假定克隆一個(gè)編碼某種蛋白質(zhì)的基因，必須考慮其表達(dá)的三個(gè)基本條件： (1)保持正確的可讀框 (2)能夠使其轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子 (3)具有翻譯的起始和終止信號(hào)36 受體細(xì)胞的感受態(tài)是接受外源DNA的生

8、理狀態(tài)_。37 DNA重組連接的方法大致分為四種：(1)黏性末端連接； (2)平末端連接；(3)同聚物接尾連接；(4)接頭連接法。38 將含有外源基因組一個(gè)酶切片段的質(zhì)粒稱(chēng)之為含有一個(gè)基因組DNA克隆_，各種此類(lèi)質(zhì)粒的集合體稱(chēng)之為構(gòu)建了一個(gè)基因組DNA文庫(kù)。39將含有一個(gè)mRNA的DNA拷貝的克隆稱(chēng)作一個(gè)cDNA_克隆，源于同一批RNA制備物的克隆群則構(gòu)建了一個(gè)_ cDNA文庫(kù)_。40只要知道基因組中某一特定區(qū)域的部分核苷酸組成，用_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以將這段DNA進(jìn)行百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。41人工感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞在溫度為0°C 時(shí)吸附DNA, 42°C _時(shí)攝人DNA

9、。42目前，在重組體的篩選中，已經(jīng)發(fā)展了許多構(gòu)思巧妙、具有極高準(zhǔn)確性的篩選方法。 大致可以分為：(1)遺傳學(xué)方法；(2)物理篩選法；(3)核酸雜交法；(4)表達(dá)產(chǎn)物分析法等。43PCR擴(kuò)增篩選重組體是比較簡(jiǎn)便的篩選方法，它適合于_插入外源片段的種類(lèi)較多，大小又極為相似的重組體的篩選。44 核酸雜交探針可分為兩大類(lèi)： DNA探針和RNA探針。其中DNA探針又分為_(kāi)基因組DNA探針和cDNA 探針。45如果用限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生5突出的黏性末端，則可以用_ Klenow酶填補(bǔ)的方法_進(jìn)行3末端標(biāo)記。如果用限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA產(chǎn)生的是3突出的黏性末端，可以用_ T4DNA聚合酶進(jìn)

10、行3末端標(biāo)記。46單鏈DNA探針的標(biāo)記可以采用下列方法：(1)用M13噬菌體載體合成單鏈DNA探針；(2)從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA探針；(3)用不對(duì)稱(chēng)PCR合成單鏈DNA探針。47根據(jù)Northern雜交的結(jié)果可以說(shuō)明：外源基因是否進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄_。48差示雜交(differential hybridization)技術(shù)需要_兩種不同的細(xì)胞群體能夠表達(dá)不同的基因，即在一個(gè)群體中能夠表達(dá)一些基因，而在另一個(gè)細(xì)胞群體中不能表達(dá)這些基因。49RNA分子經(jīng)凝膠電泳后按大小不同分開(kāi)，然后被轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜(尼龍膜) 上，同一放射DNA探針雜交的技術(shù)稱(chēng)_ Northern印跡_。50在_ Sou

11、thern印跡_技術(shù)中，DNA限制性片段經(jīng)凝膠電泳分離后，被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(或尼龍膜)上，然后與放射性的DNA探針雜交。51可用T4 DNA聚合酶進(jìn)行平末端的DNA標(biāo)記，因?yàn)檫@種酶具有_5®3合成酶_和_3 ®5外切核酸酶_的活性。52根據(jù)外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必需考慮三種因素：(1)克隆的是完整的基因；(2)使用的是表達(dá)載體；(3)不含內(nèi)含子。53Northern印跡和Southern印跡有兩點(diǎn)根本的區(qū)別： (1)印跡的對(duì)象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；(2)電泳條件不同，前者是變性條件，后者是非變性條件。54放射免疫篩選的原理

12、基于以下三點(diǎn)：(1)抗體能夠被吸附到固體支持物上；(2)同一個(gè)抗原可以同幾種抗體結(jié)合； (3)抗體能夠被標(biāo)記二、選擇題(單選或多選)1 因研究重組DNA技術(shù)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是( ) (a)AKornberg (b)WGilbert (c)PBerg (d)BMcClintock2 第一個(gè)作為重組DNA載體的質(zhì)粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl83 關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有( )不太恰當(dāng)。 (a)由作用于同一DNA序列的兩種酶構(gòu)成 (b)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶 (c)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基

13、化作用對(duì)DNA進(jìn)行修飾 (d)不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)4型限制性內(nèi)切核酸酶： ( ) (a)有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列 (b)僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供 (c)限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列 (d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供5下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶 (b)限制酶在特異序列(識(shí)別位點(diǎn))對(duì)DNA進(jìn)行切割 (c)同一種限制酶切割DNA時(shí)留下的末端序列總是相同的 (d)一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的點(diǎn)切割雙鏈DNA，產(chǎn)生黏末端 (e)一些限

14、制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生平末端6第一個(gè)被分離的類(lèi)酶是： ( ) (a)EcoK (b)Hind (c)Hind (d)EcoB7在下列進(jìn)行DNA部分酶切的條件中，控制那一項(xiàng)最好?( ) (a)反應(yīng)時(shí)間 (b)酶量 (c)反應(yīng)體積 (d)酶反應(yīng)的溫度8在下列試劑中，那一種可以螯合Ca2+離子?( ) (a)EDTA (b)檸檬酸鈉 (c)SDS (d)EGTA9在下列工具酶中，那一種可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1單鏈核酸酶 (b)末端轉(zhuǎn)移酶 (c)堿性磷酸酶 (d)Bal 31核酸酶10限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識(shí)別： ( ) (a)雙鏈DNA的特定堿基對(duì) (

15、b)雙鏈DNA的特定堿基序列 (c)特定的三聯(lián)密碼 (d)以上都正確11下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的表示方法中，正確一項(xiàng)的是( )。 (a)Sau3A I (b)EcoRI (c)hind III (d)Sau 3A112限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性是指：( )(a)在非常規(guī)條件下，識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性。 (b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快 (d)識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同13下面哪一種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因?( ) (a)甘油含量過(guò)高 (b)反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑 (c)含有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子 (d)酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過(guò)低14關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有(

16、 )不太恰當(dāng) (a)由作用于同一DNA序列的兩種酶構(gòu)成 (b)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶 (c)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基化作用對(duì)DNA進(jìn)行修飾 (d)不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)15在長(zhǎng)模板鏈的指導(dǎo)下引物延伸合成長(zhǎng)的DNA互補(bǔ)鏈時(shí)應(yīng)選用( ) (a)T4DNA聚合酶 (b)Klenow酶 (c)大腸桿菌DNA聚合酶I (d)T7DNA聚合酶16末端轉(zhuǎn)移酶是合成酶類(lèi)，( ) (a)作用時(shí)不需要模板 (b)在Ca2+的存在下，可以在突出的3，末端延長(zhǎng)DNA鏈 (c)在Ca2+的存在下，可以在隱蔽的3，末端延長(zhǎng)DNA鏈(d)上述說(shuō)法有兩種是正確的17在基因工程中，可用

17、堿性磷酸酶( ) (a)防止DNA的自身環(huán)化 (b)同多核苷酸激酶一起進(jìn)行DNA的5，末端標(biāo)記 (c)制備突出的3，末端 (d)上述說(shuō)法都正確18下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性 (a)核酸外切酶 (b)外切酶 (c)單核苷酸激酶 (d)堿性磷酸酶19 下列哪一種酶作用時(shí)需要引物? ( ) (a)限制酶 (b)末端轉(zhuǎn)移酶 (c)反轉(zhuǎn)錄酶 (d)DNA連接酶20S1核酸酶的功能是( ) (a)切割雙鏈的DNA (b)切割單鏈的RNA (c)切割發(fā)夾環(huán) (d)以上有兩項(xiàng)是正確的21Klenow酶與DNA聚合酶相比，前者喪失了( )的活性。 (a)5，-3，合成酶， (b)3，-5，外切酶 (

18、c)5，-3，外切酶 (d)轉(zhuǎn)移酶22 下面關(guān)于松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)性質(zhì)的描述中，( )是不正確的 (a)質(zhì)粒的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制的制約， 因而有較多的拷貝數(shù) (b)可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增 (c)通常帶有抗藥性標(biāo)記 (d)同嚴(yán)緊型質(zhì)粒融合后，雜合質(zhì)粒優(yōu)先使用松弛型質(zhì)粒的復(fù)制子 23 基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過(guò)的，真正的天然質(zhì)粒載體很少，在下列載 體中只有( )被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體 (a)pBR322 (b)pSCl01 (c)pUBll0 (d)pUCl8 24 下列哪種克隆載體對(duì)外源DNA的容載量最大?(

19、) (a)質(zhì)粒 (b)黏粒 (c)酵母人工染色體(YAC) (d) l噬菌體 (e) cDNA表達(dá)載體 25. 松弛型質(zhì)粒： ( ) (a)在寄主細(xì)胞中拷貝數(shù)較多 (b)可用氯霉素?cái)U(kuò)增 (c)一般沒(méi)有選擇標(biāo)記 (d)上述(a)、(b)兩項(xiàng)正確 26Col El是惟一用作基因工程載體的自然質(zhì)粒，這種質(zhì)粒： ( ) (a)是松弛復(fù)制型 （b)具有，四環(huán)素抗性 (c)能被氯霉素?cái)U(kuò)增 (d)能產(chǎn)生腸桿菌素27同一種質(zhì)粒DNA，以三種不同的形式存在，電泳時(shí)，它們的遷移速率是：( ) (a)OCDNA>SCDNA>LDNA (b)SCDNA>LDNA>OCDNA (c)LDNA&g

20、t;OCDNA>SCDNA (d)SCDNA>OCDNA>LDNA28pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，含有兩個(gè)抗性基因，其中四環(huán)素抗性基因來(lái)自： ( ) (a)ColEl (b)Ri質(zhì)粒 (c)pSCl01 (d)pUCl829關(guān)于穿梭質(zhì)粒載體，下面哪一種說(shuō)法最正確?( ) (a)在不同的宿主中具有不同的復(fù)制機(jī)制 (b)在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制起點(diǎn) (c)在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制酶 (d)在不同的宿主細(xì)胞中具有不同的復(fù)制速率30能夠用來(lái)克隆32kb以下大小的外源片段的質(zhì)粒載體是( ) (a)charomid (b)plasmid (C)cosmid (d)ph

21、agemid31第一個(gè)作為重組DNA載體的質(zhì)粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl832. Ti質(zhì)粒：( ) (a)可從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞中 (b)作為雙鏈DNA被轉(zhuǎn)移 (c)在植物中導(dǎo)致腫瘤 (d)介導(dǎo)冠癭堿的合成，作為細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物和植物的生長(zhǎng)激素 (e)需要細(xì)菌的vir基因幫助轉(zhuǎn)移 (f)在植物細(xì)胞中作為染色體外質(zhì)粒33黏粒(cosmid)是一種人工建造的載體，( ) (a)它具有COS位點(diǎn)，因而可進(jìn)行體外包裝 (b)它具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制特性 (c)進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起裂解反應(yīng) (d)進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起溶源化反應(yīng)34有兩種確定核酸中核苷

22、酸序列的方法：化學(xué)序列分析法(Maxam-Glbert)和酶學(xué)序列分析法(Sanger)。酶學(xué)測(cè)序法的基本原理優(yōu)點(diǎn)是：( ) (a)堿基與特殊染料間不同的相互作用 (b)一個(gè)合成引物的延伸和DNA修復(fù)合成的可靠終止 (c)限制性位點(diǎn)與DNA末端標(biāo)記的相關(guān)性 (d)可同時(shí)對(duì)DNA雙螺旋的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序 (e)反應(yīng)是DNA特異的，RNA不會(huì)帶來(lái)干擾。這樣既減少純化步驟，也節(jié)約了開(kāi)支。35關(guān)于cDNA的最正確的說(shuō)法是：( ) (a)同mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA (b)同mRNA互補(bǔ)的雙鏈DNA (c)以mRNA為模板合成的雙鏈DNA (d)以上都正確36用堿法分離質(zhì)粒DNA時(shí)，染色體DNA之所以可以被

23、除去，是因?yàn)椋? ) (a)染色體DNA斷成了碎片 (b)染色體DNA分子量大，而不能釋放 (c)染色體變性后來(lái)不及復(fù)性 (d)染色體未同蛋白質(zhì)分開(kāi)而沉淀37. 關(guān)于堿解法分離質(zhì)粒DNA，下面哪一種說(shuō)法不正確?( ) (a)溶液I的作用是懸浮菌體 (b)溶液的作用是使DNA變性 (c)溶液的作用是使DNA復(fù)性 (d)質(zhì)粒DNA分子小，所以沒(méi)有變性，染色體變性后不能復(fù)性38. Clark做了一個(gè)有趣的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在雙鏈DNA的 末端加一個(gè)堿基，主要是加( ) (a)dGTP (b)dATP (c)dCTP (d)dTTP39根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為基因組文

24、庫(kù)、cDNA文庫(kù)等。在下列文庫(kù)中， ( )屬cDNA文庫(kù) (a) YAC文庫(kù) (b) MAC文庫(kù) (c) 扣減文庫(kù) (d) BAC文庫(kù)40下面關(guān)于多克隆位點(diǎn)(multiple clone site,MCS)的描述，不正確的句是( ) (a)僅位于質(zhì)粒載體中 (b)具有多種酶的識(shí)別序列 (c)不同酶的識(shí)別序列可以有重疊 (d)一般是人工合成后添加到載體中41在cDNA技術(shù)中，所形成的發(fā)夾環(huán)可用( ) (a)限制性內(nèi)切核酸酶切除 (b)用3¹外切核酸酶切除 (c)用S1核酸酶切除 (d)用5¹外切核酸酶切除42在DNA的酶切反應(yīng)系統(tǒng)中，通常：( ) (a)用SSC緩沖液 (b)

25、加入Mg2+作輔助因子 (c)加入BSA等保護(hù)劑 (d)上述說(shuō)法中，有兩項(xiàng)是正確的43 黏性末端連接法，不僅操作方便，而且( ) (a)產(chǎn)生新切點(diǎn) (b)易于回收外源片段 (c)載體不易環(huán)化 (d)影響外源基因的表達(dá)44在下列表型中，( )是基因工程上理想的受體菌表型 (a)r+m+rec* (b)r-m-rec- (C)r-m-rec+ (d)r+m+rec-45關(guān)于DNA接頭在基因工程中的作用，下列說(shuō)法中哪一項(xiàng)不正確?( ) (a)給外源DNA添加適當(dāng)?shù)那悬c(diǎn) (b)人工構(gòu)建載體 (c)調(diào)整外源基因的可讀框 (d)增加調(diào)控元件46cDNA文庫(kù)包括該種生物的( ) (a)某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因

26、(b)所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 (c)所有結(jié)構(gòu)基因 (d)內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)47下列關(guān)于建立cDNA文庫(kù)的敘述中，哪一項(xiàng)是錯(cuò)誤的?( ) (a)從特定組織或細(xì)胞中提取DNA或RNA (b)用反轉(zhuǎn)錄酶合成mRNA的對(duì)應(yīng)單鏈DNA (c)以新合成的單鏈DNA為模板合成雙鏈DNA (d)新合成的雙鏈DNA甲基化 48下列對(duì)黏性末端連接法的評(píng)價(jià)中，哪一項(xiàng)是不正確的? ( ) (a)操作方便 (b)易于回收片段 (c)易于定向重組 (d)載體易于自身環(huán)化，降低重組率49關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞性質(zhì)的描述，下面哪一種說(shuō)法不正確?( ) (功具有可誘導(dǎo)性 (b)具有可轉(zhuǎn)移性 (c)細(xì)菌生長(zhǎng)的任何時(shí)期都可以出現(xiàn) (d)不同細(xì)菌

27、出現(xiàn)感受態(tài)的比例是不同的50下面關(guān)于用T4多核苷酸激酶標(biāo)記5' 端制備探針的描述中( )是不正確的。 (a)既能標(biāo)記DNA，又能標(biāo)記RNA (b)既能標(biāo)記雙鏈DNA又能標(biāo)記單鏈DNA (c)只能標(biāo)記突出的5' 端不能標(biāo)記其他類(lèi)型末端 (d)DNA或RNA必須有5'-OH的存在51Southem印跡的DNA探針( )雜交。 (a)只與完全相同的片段 (b)可與任何含有相同序列的DNA片段 (c)可與任何含有互補(bǔ)序列的DNA片段 (d)可與用某些限制性內(nèi)切核酸酶切成的DNA片段 (e)以上都是52 用下列方法進(jìn)行重組體的篩選，只有( )說(shuō)明外源基因進(jìn)行了表達(dá)。 (a)Sou

28、them印跡雜交 (b)Northem印跡雜交 (c)Western印跡 (d)原位菌落雜交53下列哪一個(gè)不是Southern印跡法的步驟?( ) (a)用限制酶消化DNA (a)DNA與載體的連接 (c)用凝膠電泳分離DNA片段 (d)DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 (e)用一個(gè)標(biāo)記的探針與膜雜交54 報(bào)告基因( ) (a)以其易于分析的編碼序列代替感興趣基因的編碼序列 (b)以其易于分析的啟動(dòng)子區(qū)代替感興趣基因的啟動(dòng)子區(qū) (c)能用于檢測(cè)啟動(dòng)子的活性 (d)能用于確定啟動(dòng)子何時(shí)何處有活性55 在利用lacZ失活的顯色反應(yīng)篩選法中，IPTG的作用是( ) (a)誘導(dǎo)宿主的肽的合成 (b)誘導(dǎo)

29、宿主的肽的合成 (c)作為酶的作用底物 (d)作為顯色反應(yīng)的指示劑56. 切口移位是指在( )作用下，使( )帶上放射性標(biāo)記。 (a)DNA聚合酶I，RNA (b)DNA聚合酶I，DNA (c)DNA聚合酶，RNA (d)DNA聚合酶，DNA57用于核酸分子雜交的探針可以是放射性標(biāo)記的( ) (a)DNA (b)RNA (c)抗體 (d)抗原58Southern印跡是用DNA探針檢測(cè)DNA片段，而Northern印跡則是：( ) (a)用RNA探針檢測(cè)DNA片段 (b)用RNA探針檢測(cè)RNA片段 (c)用DNA探針檢測(cè)RNA片段 (d)用DNA探針檢測(cè)蛋白質(zhì)片段59用免疫化學(xué)法篩選重組體的原理

30、是( ) (a)根據(jù)外源基因的表達(dá) (b)根據(jù)載體基因的表達(dá) (c)根據(jù)mRNA同DNA的雜交 (d)根據(jù)DNA同DNA的雜交 60隨機(jī)引物標(biāo)記探針，下列各項(xiàng)中哪一項(xiàng)是不正確的?( ) (a)雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA都是可以標(biāo)記的 (b)不需要用Dnase I預(yù)處理 (c)反應(yīng)時(shí)可用Klenow酶 (d)反應(yīng)時(shí)可用DNA聚合酶1 61在切口移位標(biāo)記DNA探針時(shí)只能使用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)DNA聚合酶 (d)DNA聚合酶 62要對(duì)一雙鏈的DNA分子進(jìn)行3¹末端標(biāo)記，可用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶

31、 (d)T7DNA聚合酶答案1c；2c； 3b； 4b 5b，C，d，e； 6c； 7b； 8d；9d； 10B； 11d； 12a； 13d； 14b 15d； 16c；17a，b；18a；19c；20d；21c；22C； 23b； 24C；25d；26a，C，d；27b；28c； 29b；30a；31c； 32a,c,d,e， 33a，b，c；34b； 35c；36c； 37d； 38b；39c；40a；41c； 42a，b，c； 43b； 44b； 45d； 46a；47a； 48c； 49c；50b；51c； 52c； 53b； 54a,c,d；55a； 56b；57a，b； 58c；

32、59a；60d；61b； 62c；三、簡(jiǎn)答題1說(shuō)明Sanger DNA測(cè)序法的原理。Sanger DNA測(cè)序法是建立在兩個(gè)基本原理之上：(1)核酸是依賴于模板在聚合酶的 作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶參與了細(xì)菌修復(fù)DNA合成過(guò)程)；(2)可延 伸的引物必須能提供游離的3'羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的3'羥基末 端，因此會(huì)終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行。如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會(huì)獲 得4組長(zhǎng)度不同的DNA片段。通過(guò)比較所有DNA片段的長(zhǎng)度可以得知核苷酸的 序列。2某學(xué)生在用EcoRI切割外源DNA片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因?鹽離子

33、濃度不對(duì)，溫度不對(duì)，甘油濃度過(guò)高。3在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一個(gè)6bp的類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么? 回文序列是：5'-CATATG-3，4下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)(哪些)最有可能是類(lèi)酶的識(shí)別序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 為什么?GATATC；AAATTT，因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄小?當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么?注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一 種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星活性?；?/p>

34、使用通用緩沖液。6 為什么反轉(zhuǎn)錄酶在聚合反應(yīng)中會(huì)出錯(cuò)?由于反轉(zhuǎn)錄酶缺少在Ecoli DNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚合反應(yīng)往往會(huì)出錯(cuò)，在高濃度的dNTP和Mg2+下，每500個(gè)堿基中可能有一個(gè)錯(cuò)配。7 什么是測(cè)序酶(sequenaseTM)?所謂測(cè)序酶即是修飾了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，從外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中除去28個(gè)氨基酸，這樣使T7 DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'-3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了39倍，測(cè)序時(shí)常用此酶。8 什么是S1核酸酶作圖(S1 nuclease ma

35、pping)? S1核酸酶作圖是一種對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點(diǎn)進(jìn)行作圖的方法9 YAC載體具有什么樣的功能性DNA序列?為什么在克隆大片段時(shí)，YAC具有優(yōu)越 性?YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個(gè)著絲粒，一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)，兩個(gè)端粒。YAC能夠容納長(zhǎng)達(dá)幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時(shí)能夠減少完整基因組文庫(kù)所需的克隆數(shù)目。10 列舉質(zhì)粒載體必須具備的4個(gè)基本特性。 (1)獨(dú)立復(fù)制； (2)有選擇標(biāo)記； (3)有獨(dú)特的酶切位點(diǎn)； (4)能轉(zhuǎn)化但不擴(kuò)散。11 什么叫穿梭載體？ 含有細(xì)菌質(zhì)粒和克

36、隆的真核生物DNA片段的雜種質(zhì)粒，有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和既能在細(xì)菌又能在真核細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個(gè)宿主(來(lái)回穿梭)。12 如何將野生型的l噬菌體改造成為一個(gè)理想的載體? (1)削減分子量(除去非必需區(qū)和整合區(qū))； (2)削減酶切位點(diǎn)； (3)添加選擇標(biāo)記； (4)引入終止突變13 PCR的基本原理是什么?用PCR擴(kuò)增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息? (1)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。 (2)至少要預(yù)先知道足夠合成一對(duì)引物的靶DNA序列。14 cDNA克隆與基因組克隆有何不同? 基因組克隆包含所有不在cDNA中出現(xiàn)的內(nèi)含子。15

37、 怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點(diǎn)中去?化學(xué)合成一些長(zhǎng)為10bp含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來(lái)，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中16 簡(jiǎn)述以黏粒為載體構(gòu)建基因文庫(kù)的原理。 (1)COS位點(diǎn)可以自身環(huán)化； (2)可以利用COS位點(diǎn)包裝l噬菌體顆粒； (3)可以感染寄主細(xì)胞； (4)利用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，不整合、不裂解。17 酵母人工染色體要在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定存在，必須有哪些基本的結(jié)構(gòu)? (1)著絲粒； (2)端粒； (3)ARS序列。18 何謂YAC? 主要

38、特性是什么? (1)含有來(lái)自其他生物DNA的酵母人工染色體，叫YAC； (2)主要特性是可以克隆較大的外源片段。19 Muller的PCR反應(yīng)同大腸桿菌體內(nèi)的DNA復(fù)制有哪些不同?你認(rèn)為根本的差別在 哪里? PCR用雙引物，體內(nèi)復(fù)制用單引物。20欲將一真核生物的結(jié)構(gòu)基因克隆后轉(zhuǎn)移到原核生物(如Ecoli)中進(jìn)行表達(dá)，克隆時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題?應(yīng)注意的問(wèn)題有：?jiǎn)?dòng)子、密碼子、剪接、分泌。21假定你分離到一個(gè)Ecoli的Thy- 突變體，并推測(cè)有可能是ThyA基因突變。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì) 一個(gè)方案用PCR從染色體DNA擴(kuò)增突變的ThyA基因，測(cè)定突變的序列。(注：Ecoli野生型的ThyA基因的序列是已知的)為了

39、擴(kuò)增突變體的thyA基因，先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中一個(gè)引物的序列與thyA基因的5端相同，另一個(gè)引物同該基因的3端互補(bǔ)。在引物的5端加上合適類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，以便于后來(lái)的克隆。將染色體DNA同引物混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴(kuò)增片段，可以直接測(cè)序或克隆到合適的載體再測(cè)序。22 你在做Southern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據(jù)方案，下面一步驟 是用NaOH溶液浸泡凝膠，使DNA變性為單鏈。為了節(jié)省時(shí)間，你略過(guò)了這一步， 直接將DNA從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后用標(biāo)記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。錯(cuò)在哪里?如果你的雜交探針是雙鏈的，可能因?yàn)?/p>

40、在加人雜交混合物之前忘記將探針變性而得到空白的放射自顯影結(jié)果。23切口移位(nick translation)標(biāo)記探針的主要步驟有哪些? (1)DNaseI造成切口； (2)DNA聚合酶III的5 ®3外切核酸酶進(jìn)行切割； (3)DNA聚合酶的5®3合成酶進(jìn)行修補(bǔ)； (4)在修補(bǔ)過(guò)程中，隨著切口(nick)的移動(dòng)，將放射性的底物摻人到雙鏈DNA中。24用EcoRI和Hind 分別切割同一來(lái)源的染色體DNA，并進(jìn)行克隆，在前者的克隆中篩選到A基因，但在后者的克隆中未篩選到A基因，請(qǐng)說(shuō)明原因。 原因是：Hind的切點(diǎn)在A基因內(nèi)。25什么是Western印跡?它與Southern

41、印跡有什么不同?Western印跡是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進(jìn)行檢測(cè)。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Western印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))。26用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+ Tet+的質(zhì)粒載體，已知該酶識(shí)別的是4個(gè)堿基序列， 并產(chǎn)生有兩個(gè)堿基突出的單鏈末端，該酶在lac基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個(gè)氨基 酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用 DNA聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化Lac- Tets受體菌，篩選Tetr轉(zhuǎn)化子，問(wèn)：Lac的基因型是什么?并說(shuō)明原因?；?/p>

42、因型是lac-原因是在該密碼子中插入了兩個(gè)堿基，造成了移碼突變，所以Lac的基因是缺陷的。27在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子? 這是因?yàn)榧?xì)菌沒(méi)有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子之故。四、問(wèn)答題：1 說(shuō)明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。2 什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性? 受哪些因素影向?3 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有哪些?4 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5細(xì)菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?6外切核酸酶(

43、1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么應(yīng)用?7Mn2+、Mg2+對(duì)Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影響?Dnase I在基因工程中有什么作用?8質(zhì)粒如何維持在細(xì)胞中的穩(wěn)定？9由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全，進(jìn)行 嚴(yán)格的監(jiān)控，質(zhì)粒載體的安全性是十分重要的。請(qǐng)問(wèn)質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾 個(gè)方面?10為什么野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?11 什么是藍(lán)白斑篩選法?12 藍(lán)白斑篩選法為什么也會(huì)有假陽(yáng)性?13 M13系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)?14黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足?15輔助噬菌體

44、DNA和相應(yīng)的噬菌粒是如何協(xié)同工作的?16 如果知道某一基因的功能及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過(guò)何種方法 克隆該基因?17 什么是基因文庫(kù)?18 什么是基因組文庫(kù)(genomic library)?構(gòu)建基因組文庫(kù)，涉及哪些基本過(guò)程?它同遺 傳學(xué)上的基因庫(kù)有什么不同?19 什么是cDNA文庫(kù)(complementDNAlibrary)?同基因組文庫(kù)有何差別?20 黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是也有一些不足，請(qǐng)指出 這些不足之處。21什么是同聚物加尾連接法(homopolymer tails joining)?用何種方法加尾?具有哪些優(yōu) 缺點(diǎn)?22何謂接頭連接法(

45、1inker ligation)?23什么是同裂酶?為什么說(shuō)用同裂酶進(jìn)行體外重組效率最高?24為了大量獲得許多用于生化鑒定的產(chǎn)物，你想將擬南芥中的一個(gè)序列已知、編碼單 體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物?25某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I的切點(diǎn)。現(xiàn)用 Bgl I切割該載體進(jìn)行基因克隆，問(wèn)：(1)轉(zhuǎn)化后涂皿時(shí)應(yīng)加什么樣的抗生素?(2)培 養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落具有什么樣的抗性基因型?(3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片 段的重組體?26 以pBR322 DNA作為載體，從四環(huán)素抗性基因區(qū)克隆外源DNA時(shí)，可采用環(huán)絲氨 酸富集法篩選重

46、組體，說(shuō)明其基本原理和基本操作過(guò)程。27 放射性抗體檢測(cè)法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?28 什么是隨機(jī)引物(random primer)?如何標(biāo)記DNA?29什么是印跡(blotting)雜交?30什么是原位菌落雜交(colony hybridization)?31說(shuō)明Southern雜交的原理和方法。32Northern印跡與Southern印跡有什么不同?33建立了一個(gè)基因文庫(kù)后，如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克隆?答案： 1 答： 限制性內(nèi)切核酸酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的各一個(gè)首字母，再加上序號(hào)。 基本原則： 3-4個(gè)字母組成，方

47、式是：屬名+種名+株名+序號(hào)； 首字母： 取屬名的第一個(gè)字母，且斜體大寫(xiě)；第二字母： 取種名的第一個(gè)字母，斜體小寫(xiě)； 第三字母： (1)取種名的第二個(gè)字母，斜體小寫(xiě)； (2)若種名有詞頭，且已命名過(guò)限制酶，則取詞頭后的第一字母代替。 第四字母： 若有株名，株名則作為第四字母，是否大小寫(xiě)，根據(jù)原來(lái)的情況而定， 但用正體。 順序號(hào)： 若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、 等，用正體。2 答： 類(lèi)限制酶雖然識(shí)別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限 制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來(lái)的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會(huì)松 動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性

48、通常稱(chēng)第二活性，而將這種因 條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因此第二活性又稱(chēng)為星 活性。 概括起來(lái)，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：(1)高甘油含量(>5, vv)；(2)限制性 內(nèi)切核酸酶用量過(guò)高(>100UugDNA)；(3)低離子強(qiáng)度(<25 mmolL)；(4)高pH(80 以上)；(5)含有有機(jī)溶劑，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3 答： 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有很多，但溫度對(duì)連接反應(yīng)的影響較大。黏性末端鏈通常以12°C一15°C最好，這種溫度有

49、利于末端退火和連接酶的活性穩(wěn)定。溫度高了難以進(jìn)行末端退火，低于上述溫度會(huì)降低連接酶的活性。平末端連接以室溫為宜，因?yàn)槠侥┒诉B接不存在DNA的退火問(wèn)題，但是溫度高于30，連接酶特別不夠穩(wěn)定。平末端連接時(shí)連接酶的濃度要比黏性末端連接時(shí)高10-100倍。DNA中有殘存的tRNA不會(huì)抑制DNA連接酶的活性，但是，如果NaCl的濃度高于150mmolL，則對(duì)連接反應(yīng)有強(qiáng)的抑制作用。 另外反應(yīng)體系中有NH4+離子的存在，對(duì)Ecoli DNA連接酶具有激活作用。Ecoli DNA 連接酶需要NAD+作輔助因子，而T4 DNA連接酶需要ATP。4 答： Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水

50、解DNA聚合酶I，得到兩個(gè)片段，其中大片段的分子量為75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中會(huì)降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。 Klenow酶主要有下列用途： (1)修復(fù)反應(yīng)，制備平末端 可用Klenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的5'或3'突出末端，制備平末端，這樣可以使原來(lái)具有不相容的黏性末端的DNA片段通過(guò)平末端重組。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用

51、這種末端填補(bǔ)的方法可以制備3'末端標(biāo)記的探針。 用Klenow酶修復(fù)5'突出末端的反應(yīng)主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填補(bǔ)反應(yīng)；而修復(fù)3'突出末端則是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。用Klenow酶的切割反應(yīng)來(lái)修復(fù)3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。 (2) 標(biāo)記DNA3'突出末端(protruding end) 該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，產(chǎn)生3'隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物( -32p-d

52、NTP)存在下，使降解(3'-5')作用與聚合(5'-3')作用達(dá)到平衡。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng)(exchangereplacement reaction)。不過(guò)這一反應(yīng)用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性較強(qiáng)。 (3)其他的一些用途：包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primer extension)制備單鏈DNA探針等。5答： 主要差別是：CIP68°C時(shí)失活，而B(niǎo)AP68°C穩(wěn)定，且耐酚抽提。應(yīng)用： (1)dsDNA的5'端脫磷酸，防止DNA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去后，再進(jìn)行連接反應(yīng)。 (2)DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。6答： 外切核酸酶是從 噬菌體感染的Ecoli中分離純化的，能夠從雙鏈DNA上依次切下5'單核苷酸，作用底物是雙鏈DNA的5'磷酸末端，不能切割羥基化5'端。該酶雖然能切割單鏈DNA,但效