基礎(chǔ)細胞實驗必備技能

1、第三節(jié) 實驗相關(guān)試劑和緩沖液的配制表2.3 1ml細胞裂解液的配制方法組分濃度NaClTris ( pH 8.0 )150 mM50 mMTriton X10 lAprotininLeupeptin5 l5 lPMSF1 mM表2.4 SDS-PAGE凝膠的配制方法分離膠(8ml)濃縮膠(4ml)Acrylamide concentration30% Acrylamide mix1.5 M Tris pH 8.81 M Tris pH 6.8H2O10% SDS10% Ammonium PersulfateTEMED10%2.67 ml2ml2.72 ml80 l80 l6 l12%3.2 m

2、l2 ml2.64 ml80 l80 l8 l4%0.54 ml0.5 ml1.2 ml40 l40 l3 l表2.5 SDS-PAGE電泳緩沖液配制方法組分濃度Tris baseGlycineSDS0.025 M0.25 M0.1% (W/V)表2.6 轉(zhuǎn)膜緩沖液的配制方法組分濃度Tris baseGlycineMethanol25 mM0.2 M20%表2.7 TBST漂洗液的配制方法組分濃度NaClTris-HClTween 20150 mM20 mM0.05% (V/V)表2.8 細胞質(zhì)蛋白提取液的配制方法組分濃度HEPES10 mMMgCl21.5 mMKCl10 mMDTT0.5

3、mMNP-400.05% 表2.9 細胞核蛋白提取液的配制方法組分濃度HEPES5 mMMgCl21.5 mMEDTA0.2 mMDTT0.5 mMglycerol26% 表2.10 1L的PBS緩沖液的配制方法組分含量KCl8 gNaCl0.2 gNa2HPO42H2O1.78 gKH2PO42.7 g表2.11 500ml TBE緩沖液的配制方法組分含量Tris base2.7 gBoric acid1.375 gEDTA（0.5M PH=8.0）1 ml表2.12 明膠酶譜洗脫液的配制方法組分濃度Triton X2.5%Tris-HCl (PH=7.4)50 mMCaCl25 mMZnC

4、l21 mM表2.13 明膠酶譜孵育液的配制方法組分濃度Sodium Azide0.01%Tris (PH=7.4)50 mMCaCl25 mMZnCl21 mM表2.14 明膠酶譜染色液的配制方法組分濃度Coomassie G2500.5%Ethanol30%Acetic acid10%表2.15 明膠酶譜脫色液的配制方法組分濃度Ethanol30%Acetic acid10%表2.16 5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液的配制方法組分濃度Tris-HCl250 mMSDS10% (W/V)BPB0.5% (W/V)甘油50% (V/V)-巰基乙醇5% (W/V)第四節(jié) 實驗方法2.4.1 小鼠

5、的小膠質(zhì)細胞系(BV2)和人的多巴胺能神經(jīng)元細胞（SKN-SH）的培養(yǎng)條件小鼠的小膠質(zhì)細胞是半貼壁細胞，用含有10% FBS和1%雙抗（青霉素：鏈霉素=1:1）的Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)高糖培養(yǎng)液，于37、5% CO2的條件下進行培養(yǎng)，當細胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時即可傳代，一般2天傳代一次。人的多巴胺能神經(jīng)元細胞為貼壁細胞，為了減少多巴胺能神經(jīng)元細胞的分化，用含有10%FBS和1%雙抗的Minimum Essential Medium （MEM）于37、5% CO2的條件下進行培養(yǎng)，當細胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時即可傳代，一般3-4天傳代

6、一次。2.4.2 細胞傳代小膠質(zhì)細胞于對數(shù)生長期并基本鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時進行傳代，此時細胞生長狀態(tài)良好。倒出培養(yǎng)液，分別用3mL提前37預(yù)熱的PBS沖洗2次，加1mL新培養(yǎng)液，用手拍打細胞培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下觀察，當BV2細胞基本從瓶壁脫落后，用電動移液器反復(fù)吹打細胞直至成單細胞懸液狀態(tài)，將細胞懸液按1:5分瓶的比例加入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，一般2天傳一次代。人的多巴胺能神經(jīng)元細胞的傳代為，于細胞生長狀態(tài)良好（即處于對數(shù)生長期時）并鋪滿瓶底時進行傳代。首先倒出培養(yǎng)液，分別用3mL提前37預(yù)熱的PBS沖洗2-3次，然后加入約200 l左右的胰酶進行消化，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中靜置3 min，待細胞從

7、培養(yǎng)瓶瓶壁上脫落后，立即加入1ml的培養(yǎng)液終止消化，用電動移液器反復(fù)吹打培養(yǎng)液使得細胞從集落狀分散成為單細胞懸液，將細胞懸液按照1:4的分瓶比例分到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，一般3天左右傳一次代。2.4.3 細胞凍存取對數(shù)生長期且生長良好的細胞，用37預(yù)熱的PBS沖洗3次，加200l胰酶進行消化，加入預(yù)先配制好的凍存液（10% DMSO+ 20% FBS+70%培養(yǎng)液），用電動移液器吹打細胞成單細胞懸液，將含有細胞的凍存液分裝于凍存管中，每管1 ml左右。為了減少突然降溫對細胞的損害，將凍存管放入含有異丙醇的凍存盒中于-70超低溫冰箱中程序降溫，24小時后將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。2.4.4

8、細胞復(fù)蘇從液氮罐中取出凍存管，將凍存管置于空氣中一會，使得液氮能夠充分氣化，防止凍存管突然放于37水浴后液氮大量氣化引起的爆炸。將凍存管置于37水浴中，待凍存液完全融化后，短暫低速離心（1000rpm 5min），棄上清，將下層含細胞的液體轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液于37，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察，待細胞完全貼壁后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。2.4.5細胞的藥物處理將待處理細胞種于細胞培養(yǎng)板中，24小時后待細胞處于良好生長狀態(tài)即給予藥物處理。待處理化合物一般需要提前30 min預(yù)處理，然后依據(jù)實驗所需給予不同處理，于不同時間點收取細胞。之后提取細胞內(nèi)的總蛋白，核蛋白，質(zhì)蛋白，總RN

9、A等。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達量的變化，用RT-PCR檢測細胞內(nèi)mRNA含量的變化，用ELISA法檢測細胞因子的蛋白含量。2.4.6 MTT法檢測細胞存活率待處理細胞按每孔1×104個細胞的濃度，100 l的體積種于96孔板中。細胞于37、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后用不同濃度的待處理化合物處理，20小時后，在每孔中加入20 l MTT（5mg/ml，用PBS配制，MTT見光極易分解，故配置時要注意避光），37孵育4個小時，棄上清，每孔中加入150 l DMSO。震蕩約10 min后，將96孔板放于酶標儀中，在波長490 nm下檢測其吸光度值，根據(jù)吸光度值計算出細

10、胞存活率。2.4.7 小膠質(zhì)細胞NO釋放量的測定將處于對數(shù)生長期的小膠質(zhì)細胞按照密度為3×105細胞/孔的濃度接種于12孔板中，每孔接種0.6ml，24小時后，待細胞生長狀態(tài)良好，加入不同濃度的待處理化合物，預(yù)處理30 min后，加入脂多糖（LPS）至終濃度為0.2 g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，取50 l細胞培養(yǎng)上清，分別加入50 l Griess試劑（A液：B液=1:1，A液含有1%的磺胺，5%的磷酸，B液為0.1%的-萘乙二胺二鹽酸鹽，A,B液需要避光保存），室溫反應(yīng)10min，于548 nm波長下測吸光度值，根據(jù)吸光度值和標準曲線計算出NO濃度。2.4.8蛋白免疫印跡法（we

11、stern blotting）檢測小膠質(zhì)細胞中蛋白質(zhì)表達量2.4.8.1總蛋白樣品的提取將藥物處理過的培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，放置于冰上，用4預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗12孔細胞培養(yǎng)板2次，每孔加0.6 ml預(yù)冷的PBS（如若待檢測蛋白質(zhì)為磷酸化的蛋白質(zhì)則PBS中需要分別按100:1的比例加入0.1M 氟化鈉和2mM活化后的原釩酸鈉），用移液器反復(fù)吹打培養(yǎng)板內(nèi)的細胞或用細胞刮刮細胞，直至細胞全部懸浮于PBS中，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP 管中，將EP管置于4離心機中，先以2000 rpm的轉(zhuǎn)速離心3 min，再以5000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min。倒掉PBS，向每管中加入20-40 l 蛋白

12、裂解液（蛋白裂解液中含有2%的蛋白酶抑制劑，1%PMSF，如若待檢測蛋白質(zhì)為磷酸化的蛋白質(zhì)則蛋白裂解液中需要分別按100:1的比例加入0.1M 氟化鈉和2mM活化后的原釩酸鈉），每5 min用漩渦混合器劇烈震蕩1次，裂解30min。7次裂解后，將EP管置于4低溫離心機中，12000 rpm，離心10 min，轉(zhuǎn)移含有蛋白質(zhì)的上清至0.6 ml的EP管中。2.4.8.2 BCA法蛋白定量1. 將BCA定量試劑盒中A:B液按50:1的比例混合，取96孔板，每孔加入混合液200 l，再加入濃度梯度為：0、1、3、5、7 g/l的BSA蛋白標準液各1 l和待測蛋白樣品1 l。2. 用微量振蕩器震蕩混勻

13、30s，于37孵育30 min。3. 將96孔板置于酶標儀中于562 nm波長下檢測的吸光度。4. 根據(jù)蛋白標準溶液的吸光度值繪制標準曲線，進而依據(jù)標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。5. 在收集的蛋白樣品中加入5×loading Buffer，震蕩混勻，置于沸水煮5 min，然后迅速置于冰上冷卻，使得蛋白變性，4保存?zhèn)溆谩?.4.8.3 SDS-PAGE電泳根據(jù)目的蛋白的分子量大小不同配制不同濃度的SDS-PAGE凝膠，分離膠配好后加到制膠板中，室溫靜置1小時左右，使分離膠充分凝聚。期間配置濃縮膠，濃縮膠配好后加到制膠板中，插好梳子，約1小時左右濃縮膠凝聚。從配制好的膠板中拔出梳子，

14、將膠板置于電泳槽中，加入SDS-PAGE電泳緩沖液，將收集得到的蛋白樣品點入濃縮膠的原梳子孔中。將電壓調(diào)至60 V，電泳約20 min左右，溴酚藍會在分離膠和濃縮膠界面之間被壓成一條細線，同時蛋白的maker會出現(xiàn)條帶分離，之后將電壓調(diào)至100 V，電泳大約1.5小時左右，停止電泳，進行轉(zhuǎn)膜操作。2.4.8.4 轉(zhuǎn)膜剪一塊聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），使其稍稍大于待轉(zhuǎn)的SDS-PAGE凝膠，將PVDF膜浸泡在無水甲醇中，使其活化。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，按照順序安裝轉(zhuǎn)膜材料，從電泳正極到負極的順序依次是：海綿墊，濾紙，PVDF，膜凝膠，濾紙，海綿墊。將膜置于膠上，壓緊并用手或玻璃棒擠出可能存在的氣泡，

15、合好夾板后放入電泳槽中，補滿轉(zhuǎn)膜緩沖液并放上冰盒。為了減緩轉(zhuǎn)膜過程中的放熱對實驗的影響，最后將整個電泳槽置于冰盒中。100 V轉(zhuǎn)膜1小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，卸下轉(zhuǎn)膜裝置，取出已經(jīng)轉(zhuǎn)上蛋白的PVDF膜。2.4.8.5 免疫印跡反應(yīng)1用TBST沖洗轉(zhuǎn)上蛋白的PVDF膜，于搖床上高速洗膜2次，每次5 min。2. 漂洗完畢后倒掉TBST，加入預(yù)先用TBST配制好的5%脫脂奶粉封閉液，于搖床上低速室溫孵育1小時。3. 封閉結(jié)束后，加入TBST，在搖床上高速洗膜3次，每次5 min。4. 用5%脫脂奶粉封閉液按1000:1或2000:1的比例稀釋一抗。洗完膜后，棄去TBST，加入配制好的一抗稀釋液，4過夜。5

16、. 回收一抗，加入TBST，在搖床上高速洗膜3次，每次5 min。6. 棄去TBST，加入二抗工作液（用5%脫脂奶粉封閉液按羊抗兔15000:1，羊抗鼠5000:1的比例稀釋二抗）室溫孵育1小時。7. 回收二抗，加入TBST，搖床上高速洗膜3次，每次5 min。8. 將PVDF膜置于暗盒中的保鮮膜上，向膜上均勻滴加配好的發(fā)光底物（發(fā)光底物由A，B液組成，其比例為A液：B液=1:1），用保鮮膜包好，進入暗室，放置膠片于保鮮膜上，合上暗盒曝光大約1-10 min。曝光結(jié)束后打開暗盒，將膠片放入顯影液中，待出現(xiàn)明顯且清晰的條帶時，取出膠片放入水中，漂洗除去未反應(yīng)的顯影液，然后將膠片放入定影液中，待膠

17、片背景于紅光下顯示變黑，取出膠片置于清水中，漂洗除去未反應(yīng)的定影液。取出膠片晾干。待膠片晾干后用掃描儀掃描條帶，后用image-J 2x軟件分析灰度值。2.4.8.6 核蛋白和質(zhì)蛋白的分離方法1. 質(zhì)蛋白的提取：用4預(yù)冷的PBS緩沖鹽溶液漂洗12孔細胞培養(yǎng)板2次。每孔加0.6 ml 4預(yù)冷的PBS，然后將12孔板放置于冰上。用移液器吹打細胞至細胞脫落成細胞懸液，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中。將EP管置于4低溫離心機中，首先2000rpm離心3 min，然后5000 rpm離心5 min。離心結(jié)束后，倒掉PBS，向每管加入20l的質(zhì)蛋白裂解液（裂解液中含有2%的蛋白酶抑制劑，1%PMSF），漩

18、渦混合器輕微震蕩EP管10min。每2 min一次，共6次。將EP管，取上清至另一EP管中（沉淀用來提取核蛋白）。再將EP管置于4低溫離心機中，以12000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清即是質(zhì)蛋白。用BCA法測定質(zhì)蛋白濃度后，加入5×loading Buffer，于沸水煮5 min，然后迅速置于冰上冷卻，4保存?zhèn)溆谩?. 核蛋白的提?。嘿|(zhì)蛋白提取后的沉淀中，每管中加20l核蛋白裂解液（裂解液中含有2%的蛋白酶抑制劑，1%PMSF），漩渦混合器劇烈震蕩30min，每5 min一次，共7次。將EP管置于4低溫離心機中，以12000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清即為核蛋白。用B

19、CA法測定核蛋白濃度后加入5×loading Buffer，沸水煮5 min，然后迅速置于冰上冷卻，4保存?zhèn)溆谩?.4.9 RT-PCR法檢測小膠質(zhì)細胞中mRNA的含量2.4.9.1 Trizol法提取細胞總RNA1. 將藥物處理好的小膠質(zhì)細胞從培養(yǎng)箱中取出，用預(yù)冷的PBS漂洗12孔板2遍，向每孔中加入600l Trizol試劑，室溫靜置5 min使之充分裂解。2. 將其全部轉(zhuǎn)至1.5 ml RNase free的離心管中。3. 4，12000 rpm離心5 min，棄沉淀（沉淀為細胞中的一些脂溶性成分），將上清移至新管。4. 向上清中向加入120l氯仿，劇烈顛倒混勻后室溫靜置3 m

20、in（此過程禁止用旋渦混合器）。5. 4，12000 rpm離心15 min。6. 將上層水層相移至另一新離心管中，注意不要吸到中間相。7. 每管中加入0.3ml異丙醇，劇烈顛倒混勻后室溫靜置15min（此過程禁止用旋渦混合器）。8. 4，12000 rpm離心10 min，棄上清，此時RNA 沉淀于管底。9. 每管中加入4預(yù)冷的1 ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，洗滌總RNA。10. 4，12000 rpm離心5 min，盡量將上清去除干凈，室溫放置15 min，使乙醇揮發(fā)干凈。（此過程需要用一次性PE手套蓋住管口）11. 待乙醇蒸發(fā)完后加50 l DEPC水充分溶解總RNA。1

21、2. 向上述RNA水溶液中每管中加入5 l的10×DNaseBuffer和1 l RNase-free的DNase，37靜置15 min，去除混合在RNA中的DNA。13. 每管中加入100 l比例為25：24：1的苯酚：氯仿：異戊醇的混合溶液，充分顛倒混勻，除去DNA酶。14. 4，3000 rpm 離心1 min。15. 將上清移至一新離心管中，棄沉淀，每管中加入100 l比例為24：1的氯仿：異戊醇混合溶液，充分顛倒混勻。16. 4，3000 rpm離心1 min。17.取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，每管中加入0.1倍體系體積的 NaAc ( 2M, PH 4.0 )，2.5倍體系

22、體積的-20預(yù)冷的無水乙醇，充分顛倒混勻。18. 4，12000 rpm離心15 min，棄上清。19. 向沉淀中加入1 ml 75 %的乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，洗滌RNA。20. 4，12000 rpm離心15 min。21. 重復(fù)前兩步一次。22. 棄上清，室溫靜置15 min，將乙醇揮發(fā)干凈。23. 每管中加入20 l DEPC水溶解RNA，-70保存。2.4.9.2 紫外分光光度計測樣品OD值為檢測提取出總RNA的純度和濃度，用酶標儀測量RNA樣品的OD值。因普通96孔板為塑料材質(zhì)，無法透過紫外光，故測量時用96孔石英板測量。測量前用100 l DEPC水校零。然后從RNA溶液

23、中取1 l溶于99 l DEPC水，使得待測樣品稀釋100倍，然后進行檢測，測得RNA的純度（以260/280處在1.8-2.0為最適純度）和濃度。2.4.9.3 RNA反轉(zhuǎn)錄1. 取1 g提取好的總RNA樣品和1 l的Oligo dT混勻，于PCR儀上70恒溫15 min，使RNA保持單鏈狀態(tài)，結(jié)束后冰上冷卻，3000 rpm短暫離心使液體收入管底。2. 按照如下體系加入反轉(zhuǎn)錄試劑表2.13 反轉(zhuǎn)錄體系試劑每25 l體系所需要加的試劑的量 ( l )M-MLV 5×Buffer5dNTP( mix )5RNase抑制劑( 25 units )0.5M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶( 200 u

24、nits )1DEPC水至終體積25 l3. 程序設(shè)定如下：42恒溫延伸15 min，95 變性5 min，4 恒溫1小時。2.4.9.4 PCR反應(yīng)94預(yù)變性3 min，94變性30秒，55退火30秒，72延伸30秒，27個循環(huán)，最后72延伸10 min。引物序列如表2.14：表2.14 引物序列基因序列方向均為5- 3iNOS上游引物CAGCTCCTCACTGGGACAGCACAGAiNOS下游引物CTTCCAGCCTGGCCAGATGTTCCTCCOX-2上游引物CAGCAAATCCTTGCTGTTCCCOX-2下游引物TGGGCAAAGAATGCAAACATCGAPDH上游引物GCAC

25、AGTCAAGGCCGAGAATGAPDH下游引物GCCTTCTCCATGGTGGTGAATNF-上游引物ACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTTNF-下游引物TGACCACAGTGAGGAATGTCCIL-6 上游引物TGTTTTCTGTGAAAAACGGAGC IL-6下游引物ATGACCCGTAGGGCGATTAIL-1上游引物ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACTIL-1下游引物TTTCCTTTCTTAGATATGGACAGGAC2.4.9.5瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE緩沖溶液配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠溶液。微波爐中加熱2次，每次1min。室溫冷卻后加入

26、1l的Gel Red，再倒入模具中等待瓊脂糖凝膠凝固。將凝固好的瓊脂糖凝膠置于0.5×TBE電泳緩沖液中，以120V的電壓跑膠14min后，將瓊脂糖凝膠置于Bio Rad 照膠儀中顯影。2.4.10 酶聯(lián)免疫分析法小膠質(zhì)細胞以3×105/孔的密度，以0.6ml/孔的體積接種在6孔細胞培養(yǎng)板上，24小時培養(yǎng)后，預(yù)處理不同濃度的三個化合物30min，再處理LPS至終濃度為0.2g/ml，24小時培養(yǎng)后取100l細胞上清液，37oC反應(yīng)90min， 加入100生物素標記的抗體（IL1，IL6，TNF），37oC反應(yīng)60min，之后加入 0.01M 的TBS洗滌3次，每孔里再加入1

27、00l的ABC，37oC反應(yīng)30min，加入0.01M 的TBS洗滌5次，室溫避光反應(yīng)30分鐘。 最后加入TMB終止液，于不同波長下讀數(shù)。2.4.11 條件培養(yǎng)液法小膠質(zhì)細胞以100 l/孔的體積，以每孔細胞數(shù)約為5×104個的濃度接種于96孔板。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，提前30分鐘預(yù)處理不同濃度的待測藥物，然后每孔加入0.2 g/ml的LPS進行刺激。在小膠質(zhì)細胞處理藥物的同時，將SKN-SH細胞按1×104細胞/孔的濃度，以100 l/孔的體積接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24小時后，將LPS處理24小時后的小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)SKN-SH細胞的96孔板中，48小

28、時后加入MTT 20 l，37孵育4個小時，棄去上清，每孔加入200 l DMSO，震蕩約10 min，將96孔板置于酶標儀中，在波長為490 nm的波長下檢測其吸光度值。2.4.12 DPPH自由基清除實驗用50%的乙醇溶液配制濃度為6.5×10-2mM的DPPH溶液和濃度分別為1M, 10m,100M,500M的待測樣品溶液。分別加入不同濃度的20l的樣品溶液，至80l的DPPH溶液中，均勻混合，在暗室內(nèi)避光反應(yīng)三十分鐘，用酶標儀在517nm波長處測量吸光度，計算DPPH自由基清除率。計算公式為清除率CL=1-(Ai-Aj)/A0，式中Ai為20l樣品+80l DPPH溶液所測出

29、的吸光度，式中Aj為20l樣品+80l的50%乙醇溶液所測出的吸光度，A0為20l的50%乙醇溶液+80l的DPPH溶液所測出的吸光度。以上實驗重復(fù)三次。2.4.13 明膠酶譜實驗2.4.13.1 樣品制備將密度為3×105個/孔，體積為600l/孔的無血清的小膠質(zhì)細胞混懸液接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，24小時培養(yǎng)后，預(yù)處理不同濃度的meso-dihydroguaiaretic acid, schiarisanrin A, heteroclitin D 30min后，加LPS至終濃度為0.2 g/ml，24h培養(yǎng)后，取20l小膠質(zhì)細胞的上清培養(yǎng)液，加入4×的明膠酶譜上樣緩沖液，不用煮沸，4度保存。2.4.13.2 SDS-PAGE-明膠凝膠電泳根據(jù)目的MMP9的分子量大小配制10%濃度的SDS-聚丙烯酰胺-明膠凝膠，將加有明膠和甘油的分離膠配好后加到制膠板中，室溫靜置1小時左右，使分離膠充分凝聚。期間配置濃度為4%的濃縮膠，濃縮膠配好后加到制膠板中，插好梳子，約1小時左右濃縮膠凝聚。從配制好的膠板中拔出梳子，將膠板置于電泳槽中，加入SDS-PAGE電泳緩沖液，將收集得到的上清樣品點入濃縮膠的原梳子孔中。將電流調(diào)至20mA，以恒流的方式，電泳約70 min左右，停止電泳。