聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳

1、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳一、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介一、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)?zāi)康?聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳實(shí)驗(yàn)，初步掌握聚焦電泳的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)2、基本原理、基本原理2.1蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì).在不同的ph環(huán)境中所帶的正負(fù)電荷不同。若在某特定的ph環(huán)境中其凈電荷為零,此時(shí)的ph為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在電場(chǎng)下不泳動(dòng)。2.2.等電聚焦在常規(guī)電泳中,通常只是在恒定的緩沖液中進(jìn)行分離，假定有a, b兩個(gè)蛋白質(zhì)組分，分別帶有凈電荷-3和+1。在一個(gè)ph9的緩沖洗脫中,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)均放在靠陰極一側(cè)電泳,此時(shí)帶負(fù)電荷多的a蛋白質(zhì)受陽(yáng)極影響大,泳動(dòng)速度比b快,最終會(huì)

2、超過(guò)b，這樣二者就會(huì)得到分離。在等電聚焦電泳中，分離是在連續(xù)的ph梯度中進(jìn)行的。如果把a(bǔ),b二者的混合物放在一個(gè)ph3.5-10的ph梯度中的ph6的位置，則a蛋白質(zhì)的凈電荷為-2,減少兩個(gè)凈電荷；b蛋白質(zhì)的凈電荷為+2，多了兩個(gè)凈電荷。在相同的電場(chǎng)下,a移向陽(yáng)極,b移向陰極，當(dāng)它們達(dá)到凈電荷為零時(shí)停止遷移，這種行為稱為聚焦反應(yīng)。 蛋白質(zhì)在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其等電點(diǎn)，這是一個(gè)”穩(wěn)態(tài)”過(guò)程,一旦達(dá)到等電點(diǎn)的位置，蛋白質(zhì)就會(huì)停止遷移。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，如果它要正極或負(fù)極任何一側(cè)擴(kuò)散，均會(huì)受到相應(yīng)的ph制約，即若向負(fù)極擴(kuò)散帶負(fù)電,會(huì)受到陽(yáng)極的影響，迫使其擴(kuò)散后退回原位;若向正極擴(kuò)散帶正負(fù)電,會(huì)

3、受到陰極的影響，迫使其擴(kuò)散后退回原位。因此，蛋白質(zhì)能在等電點(diǎn)位置被聚焦成一條穩(wěn)定的窄帶。2.3.兩性電解質(zhì)(1) ampholine(瑞典lkb)它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的, ph范圍2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.(2) servalyte(德國(guó)德國(guó)serva公司公司)它是在由丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合由丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合并蒸餾得到的多胺混合物中,再引入磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)引入磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)合成的. ph范圍:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.(3) pharmalyte (瑞典瑞典pha

4、rmacia)七氨基多羧基組成的ph范圍: 2.5-5, 4-5.5, 5-8, 8-10, 3-10 等(4)載體兩性電解質(zhì)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)合成的方式與ampholine基本相同. ph范圍: 3-9.5, 3.5-5.5, 4.0-6.0, 5.0-7.0, 6.0-9.0, 7.0-10.03 ph梯度的形成梯度的形成3.1在電場(chǎng)下載體兩性電解質(zhì)的變化在電場(chǎng)下載體兩性電解質(zhì)的變化在沒(méi)有電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)溶液的ph值大約是該溶液ph范圍的平均值(如ph3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液,其ph約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷,只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等,凈電荷為

5、零. 引入電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽(yáng)極移動(dòng),最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移.(1)靠近陽(yáng)極端的載體兩性電解質(zhì),電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力,使環(huán)境的ph等于載體兩性電解質(zhì)的pi,一直向陰極順延;(2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì),電正性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力,使環(huán)境的ph等于載體兩性電解質(zhì)的pi,一直向陽(yáng)極順延。如圖3.2ph梯度的形成過(guò)程梯度的形成過(guò)程ph梯度形成的時(shí)間,視正負(fù)電極之間的距離和凝膠的厚度而定.一般一塊長(zhǎng)12cm的玻璃,電極間的有效距離為10cm，凝膠的厚度為1mm，使用ampholine為載體兩性電解質(zhì),電泳1小時(shí)后ph梯度基本形成，2

6、小時(shí)后無(wú)多大變化,如圖4、實(shí)驗(yàn)流程、實(shí)驗(yàn)流程 等電聚焦凝膠溶液配制 安裝電泳槽、調(diào)水平 鋪膠 加樣 電泳 停止電泳 取膠固定 染色、脫色二、實(shí)驗(yàn)方法二、實(shí)驗(yàn)方法1、儀器準(zhǔn)備及清洗、儀器準(zhǔn)備及清洗(1)電泳槽,玻璃板三塊, 塑料模板(2)燒杯 50 ml 一個(gè)(3)量筒100ml一個(gè) 10 ml一個(gè)(4)大培養(yǎng)皿 一個(gè)2、配試劑、配試劑(每組用量)（1）固定液100ml 三氯乙酸10g 磺基水楊酸3.5g 95%乙醇35ml 加蒸餾水至100ml(2)脫色液100 ml 95%乙醇10 ml 冰醋酸7.5 ml 加蒸餾水至100ml3、實(shí)驗(yàn)步驟(1) 安裝電泳槽,調(diào)水平(先平放兩塊相同厚度玻璃板

7、,上放塑料模板,一頭用鐵夾夾住)abcde(2)配凝膠溶液 單體 2ml ampholine 0.5ml ddh2o 5.5ml temed 8l 10% ap 50l(3)灌膠, 聚膠60分鐘(4)取下玻璃板, 電泳槽上加少許液體石蠟,將坐標(biāo)紙浸透鋪平整, 坐標(biāo)紙上放帶膠玻璃板(5)加電極條:取4張濾紙條,其中兩張濾紙條浸透1mol/l 磷酸,另兩張浸透1mol/l naoh, 多余的液滴用濾紙質(zhì)吸去,然后對(duì)稱放在凝膠的兩側(cè).(6)剪取加樣紙: 按坐標(biāo)紙的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加樣紙,撥去上下覆蓋的保護(hù)紙,取出8層擦鏡紙作為加樣紙,根據(jù)樣液濃度調(diào)節(jié)加樣紙的層數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)樣4層,其它樣液均為8層).(7)加樣: 將加樣紙分別吸取樣液,成一字形排放在兩電極之間的凝膠中央.(8)連接電極: 將電極線的插頭插入電極板的插孔內(nèi),蓋上電極板,使鉑金絲壓在電極條上.蓋上安全罩,接通冷凝水.(9)電泳: 將電泳儀正極輸出端與磷酸電極條相連, 負(fù)極輸出端與naoh電極條相連,接通電源,60v恒壓15min, 8ma恒流至電壓上升到 550v,關(guān)閉電源,揭去加樣紙, 然后在550v恒壓3小時(shí)左右,等電流降至接近于零,停止電泳.(10)固定: 取出凝膠,浸泡在40ml的固定液中 搖動(dòng)約30min,傾出固定液.再加入60ml的固定液過(guò)夜.(1