實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大腸癌腹腔微轉(zhuǎn)移及其臨床意義

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大腸癌腹腔微轉(zhuǎn)移及其臨床意義 作者：錢(qián)俊 鄭樹(shù) 中西速夫 光幸秀 平井孝 加藤知行【摘要】 目的 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)大腸癌腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞并探討其臨床意義。方法 2003年5月至2004年1月，收集在日本愛(ài)知癌癥中心手術(shù)81例大腸癌病例的腹腔沖洗液，每個(gè)樣本的cDNA均應(yīng)用兩種引物合成（隨機(jī)引物和寡核苷酸引物），并在羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR（LightCycler）上進(jìn)行定量分析。每個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查。所有病例術(shù)后經(jīng)過(guò)平均為1年的隨訪。結(jié)果 CEA mRNA 和CK-20 mRNA的陽(yáng)性率和陽(yáng)性值均與腫瘤的浸潤(rùn)深度（T）、分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在一個(gè)

2、合理界定值上，CEA 和CK-20檢測(cè)的敏感度與特異度均為100%，而常規(guī)的細(xì)胞學(xué)檢查則為33%和100%。結(jié)論 CEA 和CK-20 mRNA定量分析是檢測(cè)大腸癌腹腔微轉(zhuǎn)移的敏感和特異的方法，CEA 和CK-20 mRNA水平的異常與術(shù)后的無(wú)瘤生存率顯著相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 大腸腫瘤 癌胚抗原 細(xì)胞角蛋白20 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR Quantitative Detection of Disseminated Cancer Cells in Peritoneal Washes with Real-Time RT-PCR for Patients with Colorectal Carcino

3、ma and Its Clinical Significance Abstract: Purpose To detect the free cancer cells in peritoneal cavity in patients with colorectal cancer by quantitative real-time RT-PCR method and investigate its clinical significance. Methods From May 2003 to Jan. 2004, peritoneal wash was obtained from 81 cases

4、 with colorectal cancer in Aichi cancer center. cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by 2 kinds of primers (random primer and oligo primer). Quantification of CEA and CK-20 mRNA was performed on a LightCycler instrument with hybridization probe. A part of each peritoneal w

5、ash was also examined by conventional cytology. All patients were followed up with an average period of 12 months. Results Both CEA mRNA and CK-20 mRNA positive rates and values were significantly correlated with depth of tumor invasion, staging, lymph node metastasis. Sensitivity and specificity of

6、 CEA and CK-20 real-time RT-PCR with an appropriate cutoff value were all 100%, whereas those of conventional cytology were 33%, and 100%, respectively. Conclusion Both CEA and CK-20 mRNA quantifications are sensitive and specific methods for detecting micrometastasis in the peritoneal washes with c

7、olorectal cancer. Abnormality of CEA and CK-20 mRNA in peritoneal washes is correlated with disease free survival for colorectal cancer. Key words: colorectal neoplasms; carcinoembryonic antigen; cytokeratin-20; real-time RT-PCR 大腸癌為常見(jiàn)多發(fā)的消化道惡性腫瘤，隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，大腸癌的人群患病率有所上升，并有年輕化趨勢(shì)。目前，大腸癌病人盡管接受了以

8、手術(shù)為主的根治術(shù)，但臨床上仍有50的大腸癌患者死于術(shù)后的腫瘤局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，成為手術(shù)治療失敗的主要原因1,2。因此，應(yīng)用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)、建立定量熒光RT-PCR方法檢測(cè)大腸癌腫瘤標(biāo)志物、術(shù)后轉(zhuǎn)移的早期診斷受到高度重視。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是大腸癌細(xì)胞去分化過(guò)程中表達(dá)的一個(gè)重要標(biāo)志，是最有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物之一。細(xì)胞角蛋白20（cytokeratin-20，CK-20）是上皮細(xì)胞骨架的組成成分，表達(dá)于正常上皮及上皮源性原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞。CK-20表達(dá)范圍嚴(yán)格，它僅局限在胃腸上皮細(xì)胞，且在侵襲、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散到其他組織器官時(shí)，始終保持穩(wěn)定。胃

9、腸道檢測(cè)細(xì)胞角蛋白20（CK-20）mRNA（CK-20 mRNA）可作為大腸癌患者血及骨髓轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA為內(nèi)參因子3，檢測(cè)大腸癌病人手術(shù)腹腔沖洗液中游離細(xì)胞的CEA mRNA和CK-20 mRNA，結(jié)合術(shù)后對(duì)病人隨訪，研究結(jié)果將為正確診斷腫瘤浸潤(rùn)程度和復(fù)發(fā)可能性，對(duì)大腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的早期診斷有重要意義，同時(shí)為腫瘤病人術(shù)后放療、化療方案的確定提供參考依據(jù)。 1 材料與方法 11 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移表達(dá)CEA中分化腺癌細(xì)胞株，由日本愛(ài)知癌癥中心癌癥研究所腫瘤病理實(shí)驗(yàn)室建立，并培養(yǎng)于加入1

10、0%小牛血清（GIBCO BRL, Gaithersburg），100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Nissui Pharmaceutical，Tokyo，Japan）中。 12 病例收集 收集從2003年5月至2004年6月在愛(ài)知癌癥中心手術(shù)的81例大腸癌病例，其中包括39例結(jié)腸癌，40例直腸癌，以及2例結(jié)直腸雙發(fā)癌。病例分期根據(jù)2001版UICC分期：2例0期，3例期，34例期，31例期，11例期。 13 腹腔沖洗液收集和保存 手術(shù)開(kāi)始進(jìn)腹后，立刻分別用100ml生理鹽水沖洗盆底和膈下，輕微攪拌后回收沖洗液。離心（1 800r/min，5min），PBS重新沖洗游離

11、細(xì)胞沉淀，溶解于Isogen溶液中(Nippon Gene，Tokyo，Japan)，-80保存至使用。其中一部分沖洗液同時(shí)做常規(guī)Papnicolaou染色，以進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。 1.4 RT-PCR檢測(cè) 應(yīng)用隨機(jī)引物和寡核苷酸引物檢測(cè)腹腔沖洗液游離細(xì)胞CEA mRNA，CK-20 mRNA 和GAPDH mRNA，經(jīng)細(xì)胞總RNA提取cDNA合成實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR步驟。寡核苷酸引物為：CEA引物： 5-AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT，5-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG；熒光探針：5-TGAAATGAAGAAACTACACCAGG，5-CTGCTATATCAGAGC

12、AA- CCCCAA；CK-20引物：5-CAGACACACGGTGAACTATGG，5-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG；熒光探針：5-AGACGGTCATTTAGGTTCTGCAT，5-GCCATTTTCTCATTGCCAACA；GAPDH引物：5-TGAACGGGAAGCTCACTGG，5-TCCACCACCCTGT- TGCTGTA；熒光探針：5-TCAACAGCGACACCCACTCCT，5-CACCTTTGACGCTGGGGCT。 PCR 的擴(kuò)增使用Roche的LightCycler擴(kuò)增儀，總反應(yīng)體積為10l包括：Taq DNA聚合酶，dNTP混合物和緩沖(LightC

13、ycler DNA Master hybridization probes，Roche)，4.0mM MgCl2，0.25M引物D和E，0.4M的探針，1l的模板cDNA，于Roche的毛細(xì)管中。95(10s)變性，5055(10s)淬火，72(10s)延伸，共50次循環(huán)，每次試驗(yàn)包括6個(gè)外對(duì)照管，1個(gè)陰性對(duì)照管，和未知濃度病人樣品管。mRNA的定量可在LightCycler上與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照后由軟件自動(dòng)計(jì)算得出。 1.5 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)腫瘤浸潤(rùn)深度（T）、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間CEA mRNA 值以及CK-20 mRNA值差異性分析。無(wú)瘤生存率用Kaplan-Meier方法

14、計(jì)算。 1.6 術(shù)后隨訪 所有病例均入全日本大腸癌病例庫(kù)并按照愛(ài)知癌癥中心術(shù)后隨訪程序隨訪，無(wú)失訪。隨訪截至日期到2005年12月31日。 2 結(jié) 果 1 常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查 所有81例病例均做常規(guī)病理學(xué)檢查，只有1例（1.2%）診斷為陽(yáng)性。Papnicolou 染色5級(jí)。其他71例1級(jí)，8例2級(jí)，1例3級(jí)。 2 大腸癌腹腔沖洗液中CEA水平 21 利用隨機(jī)引物合成CEA cDNA 由于每個(gè)樣本，都是用兩種不同的引物（隨機(jī)引物和寡核苷酸引物）來(lái)合成cDNA，故可以得到兩個(gè)不同的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果。CEA mRNA（利用隨機(jī)引物合成）在4個(gè)黏膜層和黏膜下層的早期癌中均未能檢出。根據(jù)以往在愛(ài)知癌

15、癥研究所的研究結(jié)果，將界定值定在1.0。大于1.0定為陽(yáng)性，小于1.0定為陰性。從盆底和膈下收集的標(biāo)本只要有一處CEA mRNA值為陽(yáng)性，該病例定為陽(yáng)性。 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，共檢測(cè)了81例腹腔沖洗液標(biāo)本，在pTis-1、pT2、pT3和pT4各組病例中，陽(yáng)性率分別為0、0、10.9%、30%(P<0.05)，各組病例的平均值分別為：0、0、31.2、12.8，T4病例較低的CEA mRNA值也反映了細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)果（0）。CEA mRNA平均值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例中陽(yáng)性率分別為5%（2/40），17.1%（7/41）(P<0.05)，CEA m

16、RNA平均值為8.03，31.05(P<0.01)。CEA mRNA在、期各組病例中，陽(yáng)性率分別為0、3%、9.6%、44.44%(P<0.05)，各組病例的平均值分別為：0、1.16、10.33、112.33(P<0.01)。腹腔轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例的CEA mRNA平均值（451.95）顯著高于腹腔轉(zhuǎn)移陰性病例（6.32）(P<0.01)。 .2 利用寡核苷酸引物合成CEA cDNA 在pTis-1、pT2、pT3和pT4病例中，陽(yáng)性率分別為0、18.2%(2/11)、41.8%(29/55)、80%(8/10)(P<0.01)

17、，各組病例的平均值分別為：0，45.87，797.08,1163.89(P<0.01)。結(jié)果與用隨機(jī)引物合成的CEA cDNA結(jié)果相一致。 CEA mRNA與腫瘤分期：在、期各組病例中，陽(yáng)性率分別為0、35.29%（12/34）、70.96%（22/31）、54.54%（6/11），各組病例的平均值分別為：0、25.38、367.55、3 022.78(P<0.01)。CEA mRNA平均值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：CEA mRNA平均值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例中陽(yáng)性率分別為 32.5%（13/40）、63.4%（26/41）(P<0.05)，平均值為

18、63.62、1 047.88(P<0.01)。腹腔轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例的CEA mRNA平均值（10 328.3）顯著高于腹腔轉(zhuǎn)移陰性病例（61.8）(P<0.01)。 .2.3 常規(guī)細(xì)胞學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 3例有腹膜轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的病例在鏡下均診斷為pT3，其中只有1例常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為陽(yáng)性（敏感度為33%）。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果均為陽(yáng)性（敏感度為100%）。 23 大腸癌腹腔沖洗液中RT-PCR檢測(cè)CK-20水平（陽(yáng)性參考值為0.1） 2.3.1 利用隨機(jī)引物合成CK-20 cDNA 在pTis-1、pT2、pT3和pT4各組病例中，陽(yáng)性率分別為0、0(0/11

19、)、14.5%（8/55)、40%（4/10）(P<0.05)，各組病例的平均值分別為：0、0、31.3、12.9，T4病例較低的CEA mRNA值也反映了細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)果（0）。 CK-20 mRNA與腫瘤分期關(guān)系：在、期各組病例中，陽(yáng)性率分別為0、3.0%（1/34）、16.1（5/31）、54.5%（6/11）(P<0.01)，各組病例的平均值分別為：0、1.10、4.49、501.96(P<0.01)。 CK-20 mRNA平均值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：CK-20 mRNA平均值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例中陽(yáng)性率分別為 7.5%（3/40）、1

20、9.5%（8/41）(P<0.01)，平均值為6.10、133.03(P<0.01)。腹腔轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例的CK-20 mRNA平均值（1 798.20）顯著高于腹腔轉(zhuǎn)移陰性病例（7.30）(P<0.01)。 2.3.2 利用寡核苷酸引物合成CK-20 cDNA 在pTis-1、pT2、pT3和pT4各組病例中，陽(yáng)性率分別為0、0、25.45%（14/55）、70%(7/10)(P<0.05)，各組病例的平均值分別為：0、0、1 160.7、40.0。T4病例較低的CEA mRNA值也反映了細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)果（0）。 CK-20 mRNA與腫瘤

21、分期：在、期各組病例中，陽(yáng)性率分別為0、17.64%（6/34）、32.25%（10/31）、45.5%（5/11）(P<0.01)，各組病例的平均值分別為：0、3.01、14.36、8 284.63(P<0.01)。 CK-20 mRNA平均值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：CK-20 mRNA平均值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例中陽(yáng)性率分別為 22.5%（9/40）、29.3%（12/41）(P<0.05)，平均值為29.63、2 208.64(P<0.01)。腹腔轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例的CK-20 mRNA平均值（28 658.63）顯著高于腹腔轉(zhuǎn)移陰性

22、病例（73.89）(P<0.01)。 應(yīng)用隨機(jī)引物和寡核苷酸引物檢測(cè)腹腔沖洗液游離癌細(xì)胞CEA mRNA與CK-20 mRNA實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果比較見(jiàn)表1。 2.4 隨訪結(jié)果 隨訪時(shí)間平均為12個(gè)月（620個(gè)月），共有7例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中包括腹腔內(nèi)播散2例，肝轉(zhuǎn)移3例，肺轉(zhuǎn)移2例。所有7例患者均為CEA或者CK-20陽(yáng)性，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為17.5%（7/40）（剔除3例陽(yáng)性對(duì)照）。其中有3例患者CEA和CK-20陽(yáng)性均為陽(yáng)性（3/9，33.3%）。其中有1例，手術(shù)時(shí)未發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移，但CEA和CK-20均為陽(yáng)性，3個(gè)月后再手術(shù)行肝轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)時(shí)，探查確認(rèn)腹膜轉(zhuǎn)移。CEA或者C

23、K-20陽(yáng)性患者與陰性患者相比較，無(wú)瘤生存率有顯著性差異（P<0.01）。CEA或者CK-20陽(yáng)性患者與兩者均為陽(yáng)性患者相比較，無(wú)瘤生存率亦有顯著性差異（P<0.01）。 討 論 大腸癌治療失敗的原因之一即是腹腔轉(zhuǎn)移。常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查一直以來(lái)作為腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)，是腫瘤TNM分期以外的又一腫瘤預(yù)后因素，但Wind等4報(bào)道，常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查并不能為大腸癌提供預(yù)后信息。腫瘤在進(jìn)行根治手術(shù)后病例仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)，原因通常被認(rèn)為是手術(shù)時(shí)腹腔內(nèi)即已存在從腫瘤漿膜面脫落的癌細(xì)胞，而這些脫落細(xì)胞通過(guò)常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查未被發(fā)現(xiàn)。本研究中，3例陽(yáng)性對(duì)照病例（腹膜轉(zhuǎn)移）病理學(xué)診斷為pT3，其中有

24、1例常規(guī)細(xì)胞學(xué)為陽(yáng)性，敏感度為33%，提示建立一種新型的能檢出腫瘤微小轉(zhuǎn)移，具備高度敏感和特異方法的必要性。以往有利用常規(guī)RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)脫落癌細(xì)胞，Aoki等5報(bào)道（2002）以CEA和CK-20為標(biāo)記物應(yīng)用常規(guī)RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)脫落癌細(xì)胞，結(jié)果提示RT-PCR的結(jié)果與腫瘤的浸潤(rùn)深度有關(guān)。但常規(guī)RT-PCR方法有以下缺點(diǎn)3：它是定性而不是定量的方法，因而缺少對(duì)于腹膜轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的定量預(yù)測(cè)?；驍U(kuò)增和隨后的分析時(shí)間長(zhǎng)，難以馬上獲得結(jié)果。有一定的假陽(yáng)性。文獻(xiàn)報(bào)道CEA為(033%)，CK-20為（08%）69。而熒光定量RT-PCR方法具有時(shí)間短（小于3h），能在手術(shù)結(jié)束之前完成。具有高度

25、敏感性，能夠檢測(cè)出107個(gè)正常細(xì)胞中的個(gè)數(shù)級(jí)別腫瘤細(xì)胞，不但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的檢驗(yàn)方法，而且敏感性?xún)?yōu)于常規(guī)RT-PCR3，10。CEA和CK-20是檢測(cè)手術(shù)時(shí)脫落癌細(xì)胞的特異性腫瘤標(biāo)記物。 本研究每種檢測(cè)標(biāo)記物均使用兩種引物來(lái)合成cDNA，熒光定量RT-PCR技術(shù)也有帶來(lái)假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)設(shè)定界值（本研究CEA為1.0，CK-20為0.1），能夠?qū)⒓訇?yáng)性控制在較低水平。同時(shí)通過(guò)兩種引物合成能夠更好地比較結(jié)果，剔除假陽(yáng)性和假陰性。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在CEA為標(biāo)記物結(jié)果中，敏感度和特異度分別為100%和100%（隨機(jī)引物），100%和100%（寡核苷酸引物）。而在CK-20位標(biāo)記物的結(jié)果中，

26、敏感性和特異性亦均為100%。研究結(jié)果表明，兩種標(biāo)記物和兩種引物結(jié)果的假陽(yáng)性和假陰性率均較低，結(jié)果較為可靠。對(duì)于同期別腫瘤，利用寡核苷酸引物較利用隨機(jī)引物合成檢出率高。同標(biāo)本隨機(jī)引物合成結(jié)果與寡核苷酸引物合成結(jié)果一致率為100%，提示在今后研究中利用雙引物合成能夠更好的提高敏感度和特異度。 本研究的結(jié)果顯示，通過(guò)兩種引物合成CEA和CK-20的陽(yáng)性率以及數(shù)值，都與腫瘤的浸潤(rùn)深度pT顯著相關(guān)(P<0.01)，同時(shí)也與腫瘤的期別呈顯著相關(guān)（P<0.01）。腫瘤的侵潤(rùn)程度越深，CEA和CK-20的陽(yáng)性檢出率就越高。本研究中出現(xiàn)了有pT3組的CEA和CK-20 mRNA平均

27、值高于pT4組的情況，這是由于pT4組病例偏少，以及3例腹膜轉(zhuǎn)移陽(yáng)性對(duì)照位于pT3組的緣故。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，兩種引物合成CEA和CK-20的水平，也與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.01)。這與之前Nakanishi等1114在胃癌中的結(jié)果是一致的。提示隨著腫瘤生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞一方面外侵，另一方面則出現(xiàn)較高概率淋巴轉(zhuǎn)移。而與Aoki等5報(bào)道的采用常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，CEA和CK-20與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)不一致。以往大腸癌病例通過(guò)淋巴結(jié)進(jìn)而導(dǎo)致腹膜播散未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)中的3例腹膜轉(zhuǎn)移陽(yáng)性對(duì)照患者，腫瘤為pT3但區(qū)域淋巴結(jié)都伴廣泛轉(zhuǎn)移，并證實(shí)周?chē)呀?jīng)有腹膜播散。說(shuō)明腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴

28、結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)而導(dǎo)致腹膜播散的可能性仍存在。 近年來(lái)對(duì)于腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念發(fā)生了改變，分為兩大類(lèi)：孤立性腫瘤細(xì)胞（isolate tumour cells，ITC），定義為單個(gè)，多個(gè)孤立性細(xì)胞或成簇腫瘤細(xì)胞，但直徑小于0.2mm；腫瘤微轉(zhuǎn)移（mircometastases）：直徑大于0.2mm腫瘤細(xì)胞團(tuán)。ITC并不表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)上的轉(zhuǎn)移如穿透血管、淋巴竇、腫瘤細(xì)胞的增生以及基質(zhì)反應(yīng)，結(jié)局有可能發(fā)展成轉(zhuǎn)移，也有可能被機(jī)體免疫所消滅1517。而熒光定量PCR能夠靈敏地檢測(cè)出ITC。Nakanishi等11報(bào)道胃癌腹腔沖洗液中CEA mRNA水平是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。Kodera等18報(bào)道CK-20 mRNA

29、水平同樣也對(duì)胃癌術(shù)后生存率有重要影響，建議用CEA和CK-20共同檢測(cè)腫瘤脫落細(xì)胞微轉(zhuǎn)移。本研究的隨訪結(jié)果也看到如此傾向，手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病例9例中有7例，其CEA或CK-20的水平在第一次手術(shù)時(shí)為陽(yáng)性，提示腹腔沖洗液中CEA或CK-20的水平異常（特別是CEA和CK-20雙陽(yáng)性）是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高危因素。是否是大腸癌獨(dú)立預(yù)后因素，有待于更長(zhǎng)期隨訪。 檢測(cè)腫瘤ITC的作用不限于此，也為腫瘤的治療提供了一個(gè)新的思路。Kurebayashi等19在乳腺癌的動(dòng)物模型，Chaudhuri等20在卵巢癌的動(dòng)物模型，均證實(shí)微轉(zhuǎn)移灶對(duì)于化療的敏感性較大轉(zhuǎn)移灶高，而Nakanishi等21在胃癌的腹腔轉(zhuǎn)移

30、裸鼠模型中證實(shí)：通過(guò)口服化療制劑后，微轉(zhuǎn)移灶可完全緩解甚至治愈，生存率高于腹腔大轉(zhuǎn)移灶裸鼠。這就為臨床治療大腸癌提供了一個(gè)新的策略，即分子水平的診斷（CEA和CK-20）以及隨后的對(duì)于具有高危因素病人的輔助化療。近年來(lái)隨著新的化療制劑應(yīng)用于大腸癌術(shù)后的輔助化療，大腸癌的生存率有了一定程度的提高。能否將此技術(shù)與大腸癌輔助化療結(jié)合起來(lái)，有待于今后進(jìn)一步研究。 綜上所述，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，測(cè)定腹腔沖洗液中CEA和CK-20的值，顯示出高于常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查的特異性和敏感性。CEA和CK-20的值與腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定腹腔沖洗液中CEA和CK-20

31、是檢測(cè)大腸癌腹腔微轉(zhuǎn)移的有效方法。腹腔沖洗液中CEA或CK-20的水平異常與大腸癌手術(shù)后無(wú)瘤生存率密切相關(guān)，是腫瘤手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高危因素。同時(shí)為臨床治療大腸癌提供了一個(gè)新的策略，即分子水平的診斷（CEA和CK-20）以及對(duì)于具有高危因素病人的輔助化療?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Safi F,Beyer HG.The value of follow-up of curative surgery of colorectal carcinomaJ. Cancer Detect Prev,1993, 17(2):417-424.2 Boring CC, Squires TS, Tong T. Cancer

32、 statisticsJ. CA Cancer J Clin, 1993, 43(1):7-26.3 Nakanishi H, Kodera Y, Yamamura Y, et al. Rapid quantitative detection of carcinoembryonic antigen-expressing free tumor cells in the peritoneal cavity of gastric-cancer patients with real-time RT-PCR on the lightcyclerJ. Int J Cancer, 2000, 89(5):4

33、11-417.4 Wind P, Norkinger B, Roger V. et al. Long-term prognostic value of positive peritoneal washing in colon cancerJ. Scand J Gastroenterol, 1999, 34(6):606-610.5 Aoki S,Takagi Y,Hayakawa M,et al.Detection of peritoneal micrometastases by reverse transcriptase-polymerase chain reaction targeting

34、 carcinoembryonic antigen and cytokeratin 20 in colon cancer patientsJ. J Exp Clin Cance Res, 2002, 21(4):555-562.6 Castells A, Boix L, Bessa X, et al. Detection of colonic cells in peripheral blood of colorectal cancer patients by means of reverse transcriptase and polymerase chain reactionJ. Br J

35、Cancer, 1998, 78(10):1368-1372.7 Yamaguchi K, Takagi Y, Aoki S, et al. Significant detection of circulating cancer cells in the blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction during colorectal cancer resectionJ. Ann Surg, 2000, 232(1):58-65.8 Ko Y, Klinz M, Totzke G, et al. Limitations of

36、the reverse transcription-polymerase chain reaction method for the detection of carcinoembryonic antigen-positive tumor cells in peripheral bloodJ.Clin Cancer Res,1998,4(9):2141-2146.9 Jonas S, Windeatt S, O-Boateng A, et al. Identification of carcinoembryonic antigen-producing cells circulating in

37、the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reactionJ. Gut, 1996, 39(5):717-721.10 Kreuzer, KA, Lass U, Bohn A, et al. LightCycler technology for the quantitation of bcr/abl fusion transcriptsJ. Cancer Res, 1999, 59(13):3171-3174.11 Ito S, Nakanishi H, K

38、odera Y, et al. Prospective validation of quantitative CEA mRNA detection in peritoneal washes in gastric carcinoma patientsJ. Br J Cancer, 2005, 93(9):986-992.12 Kodera Y, Nakanishi H, Ito S, et al. Prognostic significance of intraperitoneal cancer cells in gastric carcinoma: analysis of real time

39、reverse transcriptase-polymerase chain reaction after 5 years of follow-upJ. J Am Coll Surg, 2006, 202(2):231-236.13 Kodera Y, Nakanishi H, Ito S, et al. Quantitative detection of disseminated free cancer cells in peritoneal washes with real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a se

40、nsitive predictor of outcome for patients with gastric carcinomaJ. Ann Surg, 2002, 235(4):499-506.14 Oyama K, Terashima M, Takagane A, et al. Prognostic significance of peritoneal minimal residual disease in gastric cancer detected by reverse transcription-polymerase chain reactionJ. Br J Surg, 2004, 91(4