蛋白表達純化

1、.1 重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達和純化重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達和純化 .2 研究目的： 生物學活性 純度 數(shù)量 目的蛋白性質(zhì)： 序列 相對分子質(zhì)量 氨基酸組成 等電點 穩(wěn)定性 親水性 蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)蛋白質(zhì)表達系統(tǒng) 1. 大腸桿菌表達系統(tǒng) 2. 酵母表達系統(tǒng) 3. 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) .3 大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng) 遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達載體種類 齊全，表達效率高 基本不分泌，容易形成包涵體，無糖基化等翻譯后修飾 真核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng) 可進行分泌表達，有天然立體結(jié)構(gòu)及翻譯后修飾 表達量較低，培養(yǎng)成本較高，操作較復雜 表達系統(tǒng)選擇：目的蛋白性質(zhì)，研究目的 .

2、4 大腸桿菌表達形式大腸桿菌表達形式 可溶性表達：目的蛋白含有二硫鍵且需要正確的立體結(jié)構(gòu) 包涵體表達：無活性要求，溫度和誘導劑濃度影響 融合表達：小分子蛋白 大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體 融合表達：融合各種tag，GST,CBD,GFP等 單純表達：pJLA系列，用NcoI/NdeI導入AUG的載體 NdeI 識別序列： 5 CATATG 3 IPTG誘導：lac，T5，T7啟動子 熱誘導：lamda phage PL和PR啟動子 表達載體選擇：研究目的，目的蛋白性質(zhì)和預計純化方法 .5 .6 重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達和純化重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達和純化 步驟1. 目標基因全基因合

3、成 步驟2. 目標基因亞克隆 步驟3. E. coli 表達菌株轉(zhuǎn)化及篩選 步驟4. 目標蛋白表達及純化 .7 步驟1. 目標基因全基因合成： 1.從基因庫中搜索目標蛋白的cDNA序列。 2.根據(jù)選用的表達系統(tǒng)對cDNA進行密碼子，mRNA二級結(jié)構(gòu)等的優(yōu) 化。 3.合成設(shè)計好的基因序列，將目標基因亞克隆到合適的復制質(zhì)粒上。 提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR得到cDNA .8 步驟2. 目標基因亞克?。?1.擴增并抽提含有目標基因的載體質(zhì)粒。 2.將目標基因亞克隆到合適的表達質(zhì)粒上。 3.測序驗證構(gòu)建質(zhì)粒的準確性。 步驟3. E. coli 表達菌株轉(zhuǎn)化及篩選： 1.擴增并抽提構(gòu)建好的表達質(zhì)粒。 2.

4、將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高效的E. coli表達菌株中。 3.至少挑選5個陽性克隆于LB培養(yǎng)基中擴增并選擇合適的條件， SDS-PAGE 檢測蛋白表達情況，篩選出合適菌株。 .9 步驟4. 目標蛋白表達及純化： 1.對時間，溫度以及IPTG濃度等表達條件進行優(yōu)化，誘導表達目標蛋 白。 2. 培養(yǎng)重組細菌，通過親和，離子交換，疏水及凝膠過濾等層析方法 純化表達的重組蛋白。 3.通過SDS-PAGE電泳檢測每步結(jié)果并控制最終產(chǎn)品質(zhì)量。 4.通過Western-blot驗證目標蛋白正確性，根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)檢測其活性 .10 蛋白質(zhì)純化常用預處理技術(shù)： 1、菌體破碎。超聲、凍融、溶菌酶 2、離心沉淀。利用離心沉

5、降力將不溶性顆粒物與溶液分離的技術(shù)。 3、過濾。澄清過濾、除菌過濾 4、鹽析。常采用硫酸銨、硫酸鈉鹽析 5、等電點沉淀。根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽在等電點時溶解度最小的特點進行。 6、有機溶劑沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白質(zhì)。例如人血漿蛋白的 乙醇分級沉淀。 7、變性沉淀。根據(jù)目的蛋白質(zhì)、多肽對于溫度或者酸堿性的耐受性，在 較高的溫度或者較極端的pH條件下處理樣品，使雜質(zhì)去除的方法。 .11 蛋白質(zhì)純化常用層析方法 1、凝膠過濾。根據(jù)分子大小和形狀進行分離的一種方法，分子量較大 的先出峰，分子量小的后出峰。 2、離子交換色譜。蛋白質(zhì)、多肽均屬于兩性電解質(zhì)，在緩沖液pH小于 其等電點時，帶凈正電荷，而在

6、緩沖液pH大于其等電點時，帶凈負電 荷。陰離子交換凝膠本身帶有正電荷基團，陽離子交換凝膠本身帶負 電荷基團。由于靜電相互作用而使樣品結(jié)合到凝膠上，再采用鹽濃度 梯度或者更換緩沖液的pH值進行洗脫。對于等電點小于5.0的酸性蛋白 質(zhì)，推薦使用陰離子交換，對于等電點大于7.0的堿性蛋白質(zhì)，推薦使 用陽離子交換。 3、疏水作用色譜。利用蛋白質(zhì)、多肽在高鹽存在下，可以結(jié)合疏水凝 膠，而在鹽濃度降低時又可以解脫的原理實現(xiàn)分離。 4、親和色譜。利用蛋白質(zhì)、多肽與配基的特異性相互作用而進行分離。 5、反相色譜。常用于蛋白質(zhì)、多肽的HPLC分析，以及多肽的精細制 備分離，分辨率極高。 .12 各種色譜的主要影

7、響因素 填料性質(zhì) 樣品濃度 上樣體積 洗脫流速 工作緩沖液的pH值，離子濃度 .13 蛋白質(zhì)純化常用銜接技術(shù)： 1、透析。根據(jù)目的蛋白質(zhì)、多肽的分子量，選取適宜的透析袋進 行透析，可以起到更換緩沖液以及去除一些低分子雜質(zhì)的目的。2、 超濾。根據(jù)目的蛋白質(zhì)、多肽的分子量，選取適宜截留分子量的 超濾膜進行超濾。 3、脫鹽。透析、超濾可用于進行脫鹽，Sephadex G25、G50常 用于蛋白質(zhì)脫鹽。 .14 包含體表達蛋白的純化： 在E.coli系統(tǒng)表達重組蛋白，表達量高時，常形成包含體，包含體 易于與細胞其他組分分離，但需要注意的是蛋白復性的步驟。一般 采用鹽酸胍溶解包含體蛋白后，用稀釋的辦法進行復性，也可以利 用透析、凝膠過濾色譜等方法進行復性。 .15 .16 舉例：His-Taq DNA 聚合酶純化 性質(zhì)：6*His標簽，DNA聚合酶活性，pI 5，熱穩(wěn)定 目的： 95%以上純度，大量制備，無核