鹽堿土高效固氮蠶豆根瘤菌的篩選

1、鹽堿土高效固氮蠶豆根瘤菌的篩選DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.15.010： The nodules have been collected from Vicid faba Linn var. Chengjiangdabaidou (host plant ) in Yuxi ， Yunnan and 36 rhizobial strains were isolated and purified. To further investigate the nitrogen-fixing efficiency of the acquired rhizobia ，

2、 these rhizobia were inoculated to V. fabaLinnvar. Xiaoqingpi ， and planted in pot with soil. The plants were harvested 70 days later ，and the plant height ，the shoot dry weight and the number of nodules was determined. Taking the three factors into consideration， two strains ，Hbu610041 and Hbu61005

3、5， with the higher nitrogen-fixing efficiency ， were screened out and laid the agents foundation for V. faba production.蠶豆( Vicid faba Linn )又稱為胡豆、佛豆，為一年生(春 播)或兩年生(秋播)草本植物，糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用 作物；具有很高的營養(yǎng)價值，蛋白質含量在30%以上 1 ，具備人體需要的 8 種必需氨基酸。與大豆相比，具有高蛋白質、高淀 粉、低脂肪的特點，加工產品如蠶豆罐頭、五香蠶豆等，深受人 們青睞。蠶豆根系發(fā)達，具有較強的抗旱性，耐寒、耐

4、鹽堿，適 種范圍廣， 其中有不少種類適宜在西部地區(qū)推廣生產。 蠶豆的主要品種有臨蠶 5號、臨蠶 201、臨夏馬牙等，種植規(guī)模四川最多， 次為云南、湖南、湖北等省。據(jù)聯(lián)合國糧食農業(yè)組織統(tǒng)計 2 ， 2013年中國的蠶豆產量為 140萬 t ，占世界蠶豆產量的 40%。蠶豆可與根瘤菌形成共生根瘤， 能增強作物本身及土壤的氮 素營養(yǎng)，其根系不僅能將不易被利用的磷鉀元素轉化為有效態(tài)， 而且在生長過程中分泌有機酸 3 ，從而提高土壤肥力。此外， 接種蠶豆根瘤菌可以提高蠶豆與其他禾本科糧食作物套種的生 產效益4 ，5 。蠶豆根瘤菌的類群主要為快生根瘤菌屬，是豌豆 根瘤菌的一個生物型 6 ；蠶豆根瘤菌主要隸

5、屬種群豌豆根瘤菌( Rhizobium leguminosarum bv viciae)7 ，少數(shù)為菜豆根瘤菌( R. etli ) 8、蠶豆根瘤菌(R. fabae ) 9和拉蓋爾根瘤 菌( R. laguerreae )10 ；中國的蠶豆根瘤菌具有極大的表型 多樣性和遺傳多樣性 6 ，Tian 等7 還通過同源性分析將中國溫帶的春播型及云南省的春只有接種與豆科植物相匹配不同根瘤菌菌株之間的固氮的蠶豆根瘤菌分為亞熱帶的秋播型、 秋播均可的中間型三大類。根瘤菌具有較強的宿主專一性， 的根瘤菌才能有效提高植物的產量； 效率也不相同， 有些甚至抑制阻礙植物的生長 11 ；并且根據(jù)陳 文新 12 多

6、年的研究， 認為如果某一地區(qū)長期未種植過某一豆科 植物，則該地區(qū)的土壤中幾乎沒有與之共生的根瘤菌； 因此通過 篩選以獲得與植物互作且高效固氮的最佳“伴侶”， 預先對豆科 種子進行根瘤菌菌劑拌種， 提高植物的固氮效率， 對農業(yè)生產具 有重要意義。 目前， 關于蠶豆根瘤菌的高效固氮菌株得到了較多 的研究，王文麗等 13 、刁治民 14 、Xu 等 15 通過分離得到 了一些共生固氮能力較強的蠶豆根瘤菌， 并對植物株高、 莖葉干 重及含氮量、 根瘤數(shù)、 根瘤質量和固氮酶活性等生理指標進行了 比較，獲得了一些固氮效率高的株菌， 但同時也發(fā)現(xiàn)了有些根瘤 菌不能結瘤固氮或固氮效率較低。本研究中的澄江大白豆

7、是云南優(yōu)良豆種之一，產量可達 30004 500 kg/hm2，高的甚至可超過 6 000 kg/hm216。本研究從澄江大白豆根瘤內分離純化出根瘤菌，再將其回接到小青皮蠶豆，通過測定小青皮蠶豆的株高和干重，能力的根瘤菌。篩選出具有高效固氮1 材料與方法1.1 試驗材料宿主植物來自云南玉溪的澄江大白豆；回接植物為小青皮蠶豆，由華中農業(yè)大學資源學院耿明建教授提供。供試土壤為鹽堿土（滄州黃驊）和沙子的混合物，其體積比為4： 1,每盆0.5 kg混合沙土，裝盆之前要經過 80目的篩子 篩過。1.2 試驗方法1.2.1 樣品采集及蠶豆根瘤菌的分離純化 以云南玉溪市為 采集地點進行蠶豆的根瘤采集， 按照

8、平板劃線法 17 進行根瘤菌 的分離和純化。 具體操作流程如下： 挑選根瘤用無菌水沖洗干凈并浸泡23 h ; 75%乙醇處理5 min , 5% NaCIO處理1 min，無 菌水多次沖洗根瘤（ 5 次以上）；將消毒后的根瘤放入無菌平板 內，用無菌竹簽將根瘤壓破使根瘤內的菌液流出， 蘸取根瘤懸液 接種于YMA培養(yǎng)基平板上；28 C恒溫箱中培養(yǎng)至長出單菌落。 從平板上挑取單菌落進行革蘭氏染色并用油鏡鏡檢。 挑選革蘭氏 陰性染色，桿狀，得到純培養(yǎng)物后接種于YMA培養(yǎng)基斜面，待其長滿菌苔，部分斜面用甘油管保存，其余部分4 C保存?zhèn)溆谩?.2.2 結瘤試驗 結瘤植物蠶豆小青皮種子的萌發(fā)。 挑選光滑、

9、飽滿、粒大的小青皮蠶豆種子，先用濃硫酸處理10 min，再用清水洗 5 次以上， 消毒完畢后， 將種子置于含無菌水和濾紙的培 養(yǎng)皿（直徑15 cm）中，置于20 C,使其避光發(fā)芽，每天換 1 次無菌水（在水管下沖洗種子，搖晃培養(yǎng)皿）。蠶豆小青皮的 根瘤菌侵染試驗。3 d后，發(fā)出的蠶豆芽長至1 cm,從中挑選發(fā) 芽較好的蠶豆種子， 5個一組，放置于平板中。取每株菌制成的 2 mL 菌懸液（用無菌水）均勻滴在蠶豆種子上，使根瘤菌侵染 30 min。然后將接種好的蠶豆種子轉接到塑料盆中（10 cmx 15 cm）,種植深度2 cm,用塑料薄膜封好。每個菌株號做 5次重 復。種子發(fā)芽后剪破薄膜并定期澆

10、水，觀察植物生長情況。大約 70 d 后,測每株植株的株高和干重,記錄結果。1.2.3 蠶豆生長指標的測定 植物生長 70 d 后進行收獲。首 先觀察記錄植物莖的分枝數(shù)； 對植物的株高進行統(tǒng)計, 以第一片 真葉著生處為起點, 以植株的最高點為終點進行測量記錄； 剪取 植株地上部分裝入信封，做好標記，放入烘箱中105 C殺青2 h, 再65 C烘干至恒重；用水輕輕沖洗根部的土壤，統(tǒng)計根瘤數(shù)， 一個重復統(tǒng)計 5 株。124數(shù)據(jù)處理通過統(tǒng)計軟件SPSS寸試驗數(shù)據(jù)進行單因 素方差分析（One-way ANOVO ;在滿足方差齊性的情況下，禾U 用 Tukey 檢驗進行多重比較， 確定各因子內部不同水平

11、平均值之 間的差異顯著性。2 結果與分析2.1 分離純化得到的蠶豆根瘤菌菌株 共分離純化得到 36 株根瘤菌，選取部分菌株回接小青皮蠶豆。2.2 回接植物蠶豆小青皮的地上部分株高、干重和結瘤數(shù)利用SPSS軟件對植物株高、地上部分干重和結瘤數(shù)進行單 因素方差分析，結果見表 1 。由表 1 可以看出，接種不同蠶豆根 瘤菌菌株對株高和結瘤數(shù)影響顯著（ P 近年來， Saidi 等 25通過16S rDNA-PCR分析了從蠶豆根瘤分離的微生物，發(fā)現(xiàn) 其中有 45%的微生物與 Rhizobium leguminosarum USDA2370T 極 為相似，同源性達 99.34%，可見根瘤菌在根瘤內生菌群中占有 重要地位。 豆科植物接種根瘤菌一方面可以改善土壤營養(yǎng)， 增強 植物抗逆性， 提高農作物產量； 另一方面又可以降低化肥的施用 量