川芎嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響

1、文檔收集于互聯(lián)網(wǎng)，已重新整理排版.word版本可編借，有幫助歡迎下載支持.川茸嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響【摘要】目的探討川茅嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷時細(xì) 胞凋亡的影響及可能的機制。方法雄性SD大鼠36只隨機分三組：假 手術(shù)組、模型組、川茸嗪治療組，每組12只。用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈 前降支法制備心肌缺血再灌注模型，測定再灌注前靜脈注入川茅嗪對 損傷大鼠心肌組織中MDA, SOD生成的影響；免疫組化法檢測大鼠心肌 細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)。結(jié)果川茸嗪組能減少心肌組織中MDA 生成，并明顯提高缺血再灌注組織中SOD的活力；川茸嗪組中bcl-2 表達(dá)明顯增多，平均灰度值明顯下降，

2、與模型組比較有顯著差異 (P>0. 01), bax表達(dá)下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P> ;0. 05)o結(jié)論 川 茅嗪可能通過拮抗氧自由基、上調(diào)凋亡抑制基因bcl-2等作用，對心 肌缺.血再灌注損傷時細(xì)胞凋亡有一定的防治作用。【關(guān)鍵詞】川茸嗪；缺血再灌注損傷；自由基；心肌細(xì)胞凋 亡近年來，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡(apoptosis)是急性心肌缺血再灌 注過程中心肌細(xì)胞死亡的重要機制之一，因此深入研究急性心肌缺血 再灌注時心肌細(xì)胞的凋亡及其防治有著十分重要的意義1。細(xì)胞凋 亡的發(fā)生、發(fā)展可能與自由基損傷、中性粒細(xì)胞聚集、鈣穩(wěn)態(tài)失衡及 內(nèi)皮功能紊亂等有關(guān)，并且受多種基因調(diào)控，川莒嗪具有多種心血管

3、保護(hù)作用，近年被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病，但其在心肌缺血再灌注 損傷時心肌細(xì)胞凋亡中的作用則少見報道，現(xiàn)對此做一初步研究。1材料和方法1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠36只，體重222242 g左右。 購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。隨機分為三組：假手術(shù)組、模型組 及川茅嗪治療組，每組12只。1. 2主要儀器及試劑病理圖象分析儀（同濟影響公司 HJP-1000）；川茸嗪注射液由安徽省立藥業(yè)有限公司新特藥分公司生產(chǎn) （每支2 ml,相當(dāng)于原生藥40 mg）；免疫組化染色試劑盒（購自武漢 博士得生物工程有限公司）。1. 3心肌缺血再灌注損傷模型的建立各組動物術(shù)前禁食24 h, 20%烏拉坦（lg/kg

4、）腹腔麻醉，氣管插管，連呼吸機，機械通氣; 描記肢導(dǎo)心電圖；胸骨左緣2 mm處開胸，剪開心包，暴露冠脈，在左 前降支起點后0. 5 cm穿一絲線，墊一硅膠管，血壓穩(wěn)定時結(jié)扎，關(guān)閉 胸腔。45 min后經(jīng)尾靜脈注入治療藥物及溶液，川茸嗪治療組按50 mg/kg （按人和動物體重比例計算，為臨床劑量的5倍）的劑量給藥, 用生理鹽水稀釋到2.0 ml,再灌注前靜脈注入，其余兩組以等量生理 鹽水注入。之后打開胸腔，剪去結(jié)扎線，假手術(shù)組置線后不予結(jié)扎， 冠脈斷流及再通與否依心電圖ST段抬高及恢復(fù)為準(zhǔn)。再灌注1 h后, 取部分左室心肌立即放入中性福爾馬林溶液中固定1220 h后送病理 室，制成蠟塊標(biāo)木，連

5、續(xù)切片，其中5張嚴(yán)格按免疫組化方法進(jìn)行染 色，DAB顯色，光鏡下觀察bcl-2、bax的表達(dá)情況；再取部分左室 標(biāo)木放入儲存管中，移入-70C冰箱中留做SOD、MDA的檢測。1. 4檢測指標(biāo)1. 4. 1心肌組織中SOD、MDA含量的測定制作心肌組織勻漿，將10%的勻漿用低溫低速離心機3000 r/min左右離心10 min,留上清，然后按試劑盒要求測定SOD、MDA 含量。1. 4. 2 be 12 bax的表達(dá) 用免疫組化方法分析，切片厚4Um,常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗大鼠Bax或Bel-2單克隆抗體（1： 50 稀釋），二抗為生物素化羊抗兔IgG（l： 100稀釋），以PBS代替一抗作

6、陰性對照，DAB顯色，光鏡觀察陽性信號。胞質(zhì)染成棕黃色的為陽性 細(xì)胞。病理圖文彩色分析儀進(jìn)行半定量分析，高倍鏡下（X400）下每 組選取10個視野，對視野內(nèi)免疫組化陽性信號進(jìn)行圖象分析計算平均 灰度值，以相應(yīng)的均值分別代表每張標(biāo)木染色的深淺，最后以每組均 值進(jìn)行比較。平均灰度值與bcl-2、bax的陽性表達(dá)程度成反變關(guān)系。1. 5實驗數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 12. 0統(tǒng)計軟件, 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，采用單因素方差分析與q 檢驗，以P<0. 05為差異有顯著性。 2結(jié)果2. 1心肌組織中SOD、MDA含量的測定如表1所示，模型組MDA含量明顯高于假手術(shù)組，SOD

7、的活 力顯著降低,與假手術(shù)組比較有顯著差異（P>0. 01）。與模型組比較, 川莒嗪治療組能減少心肌中MDA的生成，有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0. 05）； 能明顯提高再灌注組織中SOD的活力，差異非常顯著（P>0.01）o2. 2各組大鼠心肌組織bax和bcl-2基因蛋白表達(dá)及圖像分免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組中bcl-2和bax均有輕度表達(dá); 模型組中bcl-2表達(dá)減少，其平均灰度值增加，與假手術(shù)組比較，差 異有顯著性(P0.01)川茅嗪組中bcl-2表達(dá)明顯增多，其平均灰度值 明顯下降，與模型組比較，差異非常顯著(P>0.01), bax表達(dá)下降, 其平均灰度值增加，但無顯

8、著性差異(P>0.05)。見表2。3討論近年來的研究表明，心肌缺血再灌注損傷的一個重要表現(xiàn)是 心肌細(xì)胞的凋亡2。心肌缺血再灌注損傷過程中產(chǎn)生大量氧自由基, 自由基可能通過以下途徑誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡:作用于細(xì)胞膜，引起膜 發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)；直接損傷DNA,誘 發(fā)細(xì)胞凋亡；影響核基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，改變細(xì)胞的表型特征，誘發(fā)細(xì)胞凋 亡；攻擊蛋白質(zhì)，使具有酶活性的蛋白質(zhì)活性喪失或減弱。川茸嗪 是從中藥川茅的生物堿中分離得到有效單體，有改善微循環(huán)，擴冠脈, 抗血小板聚集及抗血栓等多種作用，近年被廣泛的應(yīng)用于心腦血管疾 病的治療，尤其在心肌缺血再灌注損傷方而，己取得肯定療效。實驗 證明3

9、,川茸嗪能減輕氧自由基損傷，使抗氧化作用增強。木實驗 結(jié)果顯示，大鼠心肌缺血再灌注后，心肌中的SOD活性降低，MDA大 量生成同時心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。川茸嗪治療組可以明顯提高心肌組織 中SOD的活力，降低MDA的生成量，從而表現(xiàn)出減輕缺血再灌注導(dǎo)致 的損傷乃至心肌細(xì)胞的凋亡。其機制可能是通過激活抗氧化酶，提高 SOD活性，清除H202和0H.-的前身0. -2,減少過多氧自由基對組織的 損傷，終止鏈?zhǔn)降闹|(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性， 從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞凋亡兩個 方而40 Be 1-2是目前己知抑制凋亡最重要的一種基因，bax則是細(xì)

10、胞凋亡的促進(jìn)基因。BCI-2/Bax的比例被認(rèn)為是確定細(xì)胞是存活還是 死亡的關(guān)鍵因素5。研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2家族蛋白質(zhì)的活性由其磷酸 化狀態(tài)及其與其他家族成員形成同型或異形二聚體的能力所控制，一 方面，bcl-2與bn結(jié)合形成異形二聚體而使box失活；另一方面， 如bcl-2被磷酸化或Bad與bcl-2相結(jié)合，Bax就從該二聚體中釋放 出來，游離的bax,然后可以形成誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的同型二聚體，啟動 Caspase酶系級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。木實驗結(jié)果表明bcl-2 陽性表達(dá)上調(diào)可抑制心肌細(xì)胞的過度凋亡。Bax的作用與bcl-2相反, 對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。本實驗結(jié)果進(jìn)一步表明川茸嗪可明顯增

11、加 bcl-2的表達(dá)，對Bax的表達(dá)未見明顯影響，說明川茅嗪可能通過上 調(diào)凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)，增加bcl-2/Bax的比例，從而減輕心 肌缺血再灌注損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。綜上所述，川茸嗪可有效的防治心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)的 細(xì)胞凋亡，其機制可能通過拮抗自由基、促進(jìn)凋亡抑制基因的蛋口表 達(dá)等。由于川茅嗪無明顯不良反應(yīng)，貨源充足，價格便宜，故具有廣 泛的臨床應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1 Shirio k, Otanih, yamamotoF, et al Mk2-lgene knockout mouse hearts carry anti-apoptotic signal and are resistant to ischern ia reperfusion injury. Jmol cell cardiol, 2005,38(1) : 93-97.2 Mccully JD, Wakiyama H, Hsieh YJ, et al. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. AM J Physiol Heart Circ physiol, 2004, 286 (5) : 1923-1935.3 顧迎春，于曉