常用的幾種啟動子分析方法研究成果(2)

1、常用的幾種啟動子分析方法研究成果(2)3 啟動子分析方法31 生物信息學預測法目前，出現(xiàn)了很多啟動子預測程序。常見的啟動子預測軟件有：Promoter Scan ,Promoter 20 ,NNPP,EMBOSS Cpgplot 和CpG Prediction 等。啟動子及轉錄因子結合位點預測依托的主要數(shù)據(jù)庫也很多，如（1）真核生物啟動子數(shù)據(jù)庫（EPD） 主要收集了真核生物 RNA 聚合酶 II 啟動子的相關數(shù)據(jù)，這些啟動子均是已經(jīng)被注釋的，轉錄的起始位點也是通過試驗驗證的。用戶可以通過輸入核苷酸序列查找到啟動子所在的位置。數(shù)據(jù)庫將會為這些啟動子提供轉錄起始點掃描數(shù)據(jù)、相關數(shù)據(jù)庫的鏈接和原始文

2、獻的介紹9;（2） 植物 DNA 順式作用調控元件（PLACE）數(shù)據(jù)庫是從已發(fā)表文獻中搜集的植物 DNA 順式作用元件的基序（motif）10該數(shù)據(jù)庫標注了每個基序和相關文獻摘要，但是僅包含維管植物；（3） 植物順式作用調控元件 （PlantCARE）數(shù)據(jù)庫11不僅收錄了植物順式作用元件，而且收錄了植物增強子（enhancer）和抑制子（inhabitor） ;（4）轉錄因子（TRANSFAC）數(shù)據(jù)庫12是關于轉錄因子（transcription factor,TF）在基因組上的結合位點的數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)搜集的對象從酵母到人類；（5）轉錄調控區(qū)數(shù)據(jù)庫（TRRD）13是通過不斷積累真核生物基因調控區(qū)

3、結構 功能特性信息而構建的。一般在公共數(shù)據(jù)庫中，如 NCBI、UCSC、Ensemble 給出的人類基因序列都沒有對基因進行詳細的標注。不過，有很多在線工具，可以預測和分析基因序列上的啟動子、內含子、UTR區(qū)等（表 1）。生物信息學的發(fā)展為在線軟件預測基因啟動子提供了眾多有重要價值的參考信息14通過生物信息學初步預測啟動子相關信息和分析啟動子序列及其調控元件，為深入研究啟動子及確定其結構和功能奠定了基礎15唐亮等利用生物信息學技術預測人 TLR9 基因啟動子區(qū)域、轉錄因子結合位點和 CpG島分布16Huang WL17等在 ifthen 規(guī)則的基礎上提出了一種新的預測人類和果蠅啟動子的方法，并

4、命名為 PromHD 方法。32 酵母單雜交實驗（Yeast OneHybrid System）酵母單雜交技術18是一種研究細胞內的蛋白質和 DNA 序列特異性相互作用的方法。GAL4 蛋白作為酵母單雜交系統(tǒng)中的一種典型的轉錄因子，其 DNA 結合域接近羧基端，包含多個鋅指結構，可以激活酵母半乳糖苷酶激活位點（UAS），而上游的轉錄激活結構域能夠與 RNA 聚合酶或轉錄因子 TFIID 交互作用，提高 RNA 聚合酶的活性。在這個過程中，DNA 結合結構域和轉錄激活域可以完全獨立起作用。因此，我們可以將 GAL4DNA 結合結構域以文庫蛋白編碼基因取代，一旦表達的蛋白質可與目的基因交互作用，一

5、樣能夠通過轉錄激活結構域使RNA 聚合酶激活，啟動下游報告基因轉錄19酵母單雜交（Y1H）系統(tǒng)20是一個功能強大的工具，用來鑒定可以結合到目的 DNA 元件上的蛋白質，包括 cDNA 的轉錄因子21,甲基化 DNA 結合蛋白22和 DNA 的復制起點23與端粒結合蛋白24Y1H 系統(tǒng)與酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H）在概念上相似，這是由 Field 和 Song25在轉錄激活蛋白的基礎上發(fā)明的。此方法也在不斷地進行改進。Deplancke26開發(fā)了互換兼容的 Y1H系統(tǒng)，不僅方便，高通量，而且可以無偏差地鑒定蛋白質 DNA相互作用。酵母單雜交技術在啟動子研究中得到了很好的應用。Li 等應用酵母單雜交篩

6、選 11 個堿基庫發(fā)現(xiàn) TALEs 分別激活SCN9A 和 miR34b27通過酵母單雜交篩選，分離得到兩個轉錄因子 IbNAC1 和 IbWRKY1,而且它們都與 SWRE（sporamin蛋白損傷響應元件）的調控序列的 sporamin 蛋白啟動子片段進行交互作用28在對擬南芥的研究中，酵母單雜交實驗證明WRKY75 蛋白結合 CAPRICE 啟動子29在煙草葉本生中，EOT1 蛋白能夠特異激活 SlTPS5 啟動子30酵母單雜交作為一種分子生物學技術19,其過程簡單，耗時短，能直接識別并定位順式作用元件結合的蛋白及其編碼序列，而不必用生化手段來純化蛋白或抗體建立這種復雜的相互作用，并使得

7、確定基因功能不再是一個艱巨的任務，從而更容易進一步理解在真核生物基因表達調控；而且酵母是真核細胞，在酵母體內研究與真核基因表達調控的實際情況接近，天然構象的蛋白也避免了體外研究的不足。Yan 和 Burgess31開發(fā)了一種酵母逆單雜交系統(tǒng)，它使得快速和全基因組的轉錄結合靶標的鑒定成為可能。然而酵母細胞局限性在于自身因插入靶元件可能會與酵母內源性的表達激活因子發(fā)生相互作用，從而激活啟動子下游報道基因的表達，這樣相應的目的基因片段有可能會被漏檢，Collart MA 等32提出該技術的靈敏度不高，HIS3 基因表達相當敏感，甚至對某些非特異性相互作用都能檢測到，插入的靶元件可能無需轉錄激活因子的

8、激活就能激活報道基因的表達，使假陽性克隆的比率得以提高。不過這些非特異的相互作用可通過設計其他技術避免。33 染色質免疫共沉淀（ChIP）染色質免疫共沉淀3335是在生理條件下將細胞內的蛋白質與 DNA 進行交聯(lián)并在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質DNA 復合物，在超聲波作用下將其隨機切斷成一定長度的染色質片段，然后沉淀該復合物，特異性富集目的蛋白結合的 DNA 片段，經(jīng)過 DNA 純化以及其鑒定，而獲得蛋白質和 DNA 相互作用的信息。利用該技術研究啟動子目前通常用的是染色質免疫共沉淀 芯片 （ChIPchip） 和將 ChIP 與第二代測序技術相結合的ChIPseq 技術。ChIPseq 和 ChI

9、Pchip36可以在全基因組范圍內研究 DNA 和蛋白質的相互作用，進一步用于研究基因表達調控，這對于探討各種生物過程具有重要意義。細胞內轉錄因子通過與核酸直接交互作用等方式起到了重要的轉錄調控作用。它們通常特異性結合在轉錄起始位點上游的啟動子區(qū)域，以調節(jié)基因的轉錄。ChIP 技術和啟動子芯片的有機結合，能夠確定任何一個特定轉錄因子靶基因群。目前這兩種技術應用也越來越廣泛。Lee SB37等用 ChIP方法證實鋅指蛋白 Nrg11 與體內葡萄糖抑制基因的特定啟動子區(qū)域相互作用。Juneja M38等構建了一個啟動子熒光素酶報告基因的載體，直接觀察 MACC1 的轉錄從而鑒定 MACC1 啟動子

10、的作用。并且采用電泳遷移率變動分析和染色質免疫沉淀實驗，證實這些轉錄因子與一個極其重要的 MACC1 核心啟動子序列的物理性相互作用。ChIPchip 和 Chipseq 兩種方法也可以結合來使用，Lei H39等同時采用 ChIPseq 和 ChIPchip 兩種方法，對已知的研究得比較清楚的轉錄因子進行結合位點檢測，產(chǎn)物強烈重疊的結果揭示了 HLH1 優(yōu)先與基因富集 Ebox序列（CANNTG）的啟動子區(qū)域結合。ChIP 技術可以在體內反應；經(jīng)過蛋白質 蛋白質相互作用，直接或間接的識別基因組與蛋白質的相關位點；能夠得到一個簡單的圖像在一個給定檢驗細胞環(huán)境的模式下。可是它需要一個特異性蛋白質

11、抗體，有時難以獲得；可能需要限制在組織來源中獲取調控蛋白質的基因；想要得到高豐度的結合片段，必須在胞內條件下實驗演示靶蛋白的表達情況。34 瞬時轉染法（Transient transfection）瞬時轉染40是在一定的轉染程序下，將含目的調控區(qū)的質粒導入培養(yǎng)細胞。在典型情況下，調控區(qū)調控報告基因的轉錄。無論在 mRNA 水平還是在蛋白質水平上，報告基因是易于被檢測到的基因，含報告基因的質粒在培養(yǎng)的細胞中轉錄，在某一特定時間對其合成的 mRNA 或蛋白質進行檢測，用來評價調控區(qū)的活性。瞬時表達系統(tǒng)是研究啟動子功能及活性的重要手段之一。由于在受體植物細胞內瞬時性表達的外源基因是游離于染色體之外的

12、，因此，受體植物基因組對其產(chǎn)生的影響相對較小，其啟動子活性基本反映了啟動子本身的表達特性41,42Zi C43等構建了 pGL3 啟動子的報告基因載體，瞬時轉染 HEK293 細胞，證明了 FUT1 基因的啟動子活性。利用瞬時性表達系統(tǒng)可以定性和定量地研究 CMV 啟動子的表達活性。通過熒光檢測法證明啟動子可指導 GUS 基因的瞬時性表達44,Li ZL45等構建了EGR1 啟動子腺病毒穿梭載體，采用瞬時轉染的方法研究 EGR1 啟動子對乳腺癌細胞輻照的敏感性的影響。瞬時轉染法優(yōu)缺點：瞬時轉染分析法快捷、簡單，易于對結果定量，因此成為啟動子功能分析的首選方法。瞬時轉染分析法也有兩個主要局限性：

13、首先在被轉染的細胞中，質粒的人工構象和拷貝數(shù)可能會導致特異性調控元件失活或具有特異功能；其次，瞬時轉染分析法不能用于檢測那些需誘導或分化時間超過 4872 小時期限的研究。35 凝膠阻滯分析實驗（EMSA）凝膠遷移或電泳遷移率分析（Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA）46,47是一種研究 DNA 與特異性蛋白的交互作用的技術，起先用于研究 DNA 特異序列和相關的 DNA 結合蛋白的相互作用。當前它的使用已不限于 DNA 方面，可用于研究特定的 RNA 序列和 RNA 結合蛋白的相互作用，也可用于定性和定量分析 這種技術起源于對 rRNA 基因

14、蛋白相互作用的早期工作48,49,它廣泛應用于細菌轉錄因子的研究。凝膠遷移實驗基本過程是50,將 32P 標記或非放射性標記的包含特異的 DNA 位點的 DNA 片段與 DNA 結合蛋白共同孵育，Wolf SS 等也提出了用 33P 標記的 EMSA 的應用51,蛋白 DNA 復合物通過非變性凝膠電泳能夠與游離 DNA 分離開來，蛋白質阻礙與其所結合的 DNA 片段的移動性。因此，游離DNA 比 DNA 蛋白復合物移動得更快，凝膠的圖像可以揭示游離和結合的放射性標記的 DNA 的位置?，F(xiàn)在由于健康、安全和環(huán)境問題，對非放射性檢測的需求日益增加，在目前的研究中提出了非放射性標記的凝膠阻滯分析，并

15、且可以研究蛋白質和啟動子 DNA 序列的相互作用52基于傳統(tǒng)的 EMSA,Humphries53開發(fā)出了一些結合方法。采用競爭性電泳遷移率變動分析方法鑒定了一種以前未報道過的干細胞核因子 3 位點，它提供了低成本但是高通量的輔助工具，使用未標記的 DNA 競爭陣列鑒定不確定 DNA 結合蛋白。凝膠電泳阻滯分析在分析化學中起重要作用，比如定量生物科學和即時檢驗分析。Jiang X 等54用 EMSA 方法證明了AP1 能夠結合在啟動子的功能區(qū)域，并且調控人 LoVo 細胞的PPARdelta 的表達。Katanin 是參與微管切斷 ATP 酶家族成員的蛋白質，它的兩種異源二聚體結構由 KATNA

16、1 和 KATNB1編碼，而 Elk1 能夠與微管相互作用，Sel觭uk E 等55用 EMSA 方法證明 Elk1 能夠結合 KATNB1 啟動子，調控其表達。凝膠阻滯電泳分析顯示青蒿素激活 PXR 與 CYP3A4DNA 結合的能力，表明 CYP3A4 的誘導是由青蒿素通過 PXR 的活化所介導56凝膠電泳阻滯分析方法分析了肝 X 受體基因 NR1H3 啟動子多態(tài)性57EMSA 本身有很多不足，如不同片段之間親和力大小難以比較；不能鑒定蛋白復合體與 DNA 的結合；低親和力結合很難識別；鑒于體外環(huán)境和體內環(huán)境存在巨大差異，EMSA 難以真正重建蛋白質和 DNA 之間在體內的結合過程。 因此

17、有必要對 EMSA 技術進行改進或開發(fā)更好的蛋白質和 DNA 相互作用的技術。也常采用與其它方法結合聯(lián)合驗證。Aung KM 等人采用傳統(tǒng)的 EMSA 和熒光各向異性 （FA） 以及以一個金粒子（AuNPs） 為基礎測定法，來研究 DNA 結合 FOXA1 和 FOXA1DNA 的配體干擾的性質58EMSA 操作過程中使用的丙烯酰胺溶液有毒，所以 Vanek PG 等人利用 TreviGel500,一種無毒的能替代聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移分析59,但是 TreviGel500 比較貴，用起來不實惠。36 DNase I 足跡法（DNase I footprinting）DNase I 足跡法是

18、一種定位蛋白質結合 DNA 的特異性結合位點的技術。先將含有特定順式元件的雙鏈 DNA 片段進行單鏈末端標記，然后加入恰當濃度的 DNase I,對 DNA 蛋白質復合物進行酶切，形成了不同長度的 DNA 片段，最好使其相鄰的 DNA 片段只差一個核苷酸，然后片段經(jīng)變性后 PAGE 電泳分離，放射自顯影，便可形成只有一個核苷酸差異的 DNA 梯形帶。假如 DNA 片段與相應的序列特異性 DNA 結合蛋白結合，結合蛋白保護磷酸二酯骨架免受 DNA 酶 I 催化水解，周圍的結合蛋白阻止 DNA 酶結合其結合位點，因而在放射自顯影圖譜上，間斷的結合區(qū)域，就會產(chǎn)生分裂梯足跡,于是被形象地稱作足跡法。DNase I 由于空間位阻不能綁定直接相鄰的 DNA結合蛋白，因此，足跡特征比較明顯，一般比自身位點大 810（bp）個堿基對。Brenowitz 等60介紹了用足跡法定性鑒定粗提取物中 DNA結合蛋白。Carey MF 等61在前人的基礎上就 DNase I 分析方法的具體操作步驟作了詳細描述。DNase I 也是最常用的