《編免疫組化》PPT課件.ppt

1、免疫細(xì)胞（組織）化學(xué)技術(shù) 病理教研室 金曉明,主要講述內(nèi)容： 第一部分 免疫細(xì)胞化學(xué)的理論基礎(chǔ) 第二部分 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 第三部分 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 第四部分 免疫電子顯微鏡技術(shù),第一部分 免疫細(xì)胞化學(xué)的理論基礎(chǔ) 免疫細(xì)胞化學(xué)是免疫學(xué)與細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合的一個(gè)分支學(xué)科，以免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)為其理論基礎(chǔ),第一節(jié) 抗原（antigen） 一、抗原的概念 是一類在合適的條件下，能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)和/或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。 抗原的性能：免疫原性 產(chǎn)生免疫應(yīng)答 反應(yīng)原性 產(chǎn)生特異性反應(yīng),二、抗原決定簇 是與相應(yīng)抗體或淋巴細(xì)胞抗原識(shí)別受體相結(jié)

2、合的部位，是決定和控制抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。 類型：功能性抗原決定簇 隱蔽性抗原決定簇 免疫優(yōu)勢(shì)決定簇 線性或連續(xù)性決定簇 構(gòu)象決定簇或不連續(xù)性決定簇 B 細(xì)胞所識(shí)別的是半抗原決定簇；T細(xì)胞所識(shí)別的是免疫原性決定簇或連續(xù)性決定簇,三、抗原的性質(zhì)與種類 （一）抗原的性質(zhì) 1、抗原的異物性 機(jī)體能對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的異種、異體的大分子物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。該物質(zhì)與機(jī)體的種系關(guān)系愈遠(yuǎn)，其免疫原性愈強(qiáng)，機(jī)體的免疫反應(yīng)也更強(qiáng)。 自身抗原；自身抗體 2、大分子膠體 作為抗原，分子愈大，其免疫原性愈強(qiáng) 3、抗原的特異性 各種抗原物質(zhì)各有其特異的抗原決定簇，即一種抗體只能與相應(yīng)的抗原起反應(yīng)而不能與其它抗原反應(yīng),二）抗

3、原的種類方法 分類依據(jù) 種類 單獨(dú)存在時(shí)是否有免疫原性 半抗原和完全抗原 抗原來(lái)源 外源性抗原和內(nèi)源性抗原 抗原與宿主關(guān)系 異種抗原，同種異體抗原，自身抗原 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體時(shí)是否需要T細(xì)胞輔助 胸腺依賴抗原，胸腺非依賴抗原 化學(xué)物質(zhì) 蛋白質(zhì)，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白， 核酸等 物理狀態(tài) 顆粒性抗原，可溶性抗原 產(chǎn)生方式 天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原 抗原特異性程度 特異性抗原，共同抗原,完全抗原：同時(shí)具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)。 不完全抗原或半抗原：無(wú)免疫原性,第二節(jié) 抗體（antibody） 一、抗體的概念 機(jī)體受到抗原刺激后，通過(guò)體液免疫應(yīng)答，B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化為漿細(xì)

4、胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白。 二、抗體的性質(zhì)和種類 （一）抗體的一般性質(zhì) 免疫球蛋白約等于抗體，分五類：IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,二）免疫原性和分類特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白質(zhì)，具有免疫原性，課作為抗原。由于存在著輕鏈和重鏈，可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)，因此，分子結(jié)構(gòu)差異較大，免疫原性比較復(fù)雜。 （三）抗體的種類 1、根據(jù)抗體的途徑或來(lái)源不同分為 免疫抗體；天然抗體；自身抗體 2、根據(jù)抗原抗體在試管內(nèi)是否出現(xiàn)肉眼反應(yīng)分為 完全抗體；不完全抗體,三、抗原與抗體反應(yīng) 稱為免疫學(xué)反應(yīng)。 在體內(nèi)進(jìn)行稱為免疫反應(yīng)；在體外稱為血清學(xué)反應(yīng) 四、抗體形成的機(jī)制 （一）免疫應(yīng)

5、答的產(chǎn)生 1、感應(yīng)階段（識(shí)別及加工處理抗原階段） 2、反應(yīng)階段（淋巴細(xì)胞增殖分化階段） 3、效應(yīng)階段（發(fā)生免疫反應(yīng)階段） （二）影響抗體產(chǎn)生的因素 1、抗原的質(zhì)和量 2、機(jī)體方面 3、佐劑的增強(qiáng)免疫作用,第三節(jié) 有關(guān)基本技術(shù)方法 一、抗體的制備 （一）抗體的制備方法 能制備出具有很高特異性和敏感性的高效價(jià)多克隆和單克隆抗體,1.多克隆抗體（血清抗體：指機(jī)體接受抗原主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后從血清中分離提純的抗體。 2.單克隆抗體：是1975年由Kohlenh Milstein發(fā)明的一種新技術(shù)。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞和免疫的脾細(xì)胞相融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這種融合的雜交細(xì)胞既有骨髓細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)能力

6、，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細(xì)胞純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb,單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較 特性 多克隆 單克隆 組成 多種類抗體的混合物 單一種類的抗體 特異性 低 高 針對(duì)多個(gè)抗原決定族 針對(duì)單一的抗原決定族 親和力 平均親和力較高 不定，較低 交叉反應(yīng) 高 低,二）抗體的配制方法 1、抗體貯存 2、抗體使用液的配制,二、組織材料的處理 盡量保存好抗原性不丟失、不擴(kuò)散、不被破壞 三、免疫染色 1、增強(qiáng)特異性染色方法 蛋白酶消化法；合適的抗體稀釋度；溫育時(shí)間 2、減少或消除非特異性染色方法

7、 3、顯色反應(yīng)的控制 4、復(fù)染,四、對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照；陰性對(duì)照 五、結(jié)果的判斷 （一）陽(yáng)性細(xì)胞的染色特性 1、分胞漿、細(xì)胞核、細(xì)胞膜表面陽(yáng)性 2、灶狀和彌漫性 3、非特異性的認(rèn)知 4、切片質(zhì)量不佳出現(xiàn)的陽(yáng)性要排除 （二）染色失敗的幾種原因,第二部分 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù) Coons等（1941）通過(guò)熒光標(biāo)記抗體，并借助于熒光顯微鏡觀察熒光的發(fā)光物質(zhì)，而建立的該項(xiàng)技術(shù)。 近年來(lái)，與激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)、掃描電鏡等技術(shù)的結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光技術(shù)。加之熒光激活細(xì)胞分類器的應(yīng)用和激光共聚焦顯微鏡的問(wèn)世，開(kāi)創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域,第一節(jié) 原理 一、基本原理 免疫熒光技術(shù)也是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將

8、已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。 二、熒光產(chǎn)生的原理 分子都含有電子，電子載不斷的運(yùn)動(dòng)著。 一般情況下，電子總是處于能量最低的能級(jí)（即基態(tài)） 在一定的條例下，電子可吸收能量躍遷到較高的能量級(jí)（即激發(fā)態(tài)），這個(gè)過(guò)程叫激發(fā),二、熒光素 1、熒光色素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為。 特性：必須具備吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光；具有吸收 一定頻率光能的生色團(tuán)和能產(chǎn)生一定光亮子的熒光 團(tuán),2、用于標(biāo)記抗體的熒光素必須具備以下條件： 1）應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基因，結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)

9、物容易排除。 2）熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合熒光效率下降不多。 3）結(jié)合抗體蛋白后對(duì)抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無(wú)影響。 4）與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡(jiǎn)便而快速。 5）熒光素容易溶解，溶解后不會(huì)與其它物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 6）熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對(duì)比鮮明，能清晰判斷結(jié)果,3、熒光素的類型 1）異硫氰酸熒光素（fluorescien isothocyanate, FITC) 2）四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（tetraethyl rhodamine isothocyanate, TRITC) 3）四乙基羅達(dá)明（tetraethyl rhodamine, RB200) 4）其它,三、免疫熒光染色方法 1、

10、直接法：用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異 性熒光抗體，直接用于細(xì)胞和組織抗原的檢查。 優(yōu)點(diǎn)：特異性高 缺點(diǎn)：一種熒光 抗體只能 檢測(cè)一種 抗原,2、間接法：用特異性的抗體（1抗）與細(xì)胞或組織標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖液洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（2抗）與結(jié)合再抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原 抗體 熒光抗體的復(fù)合物。 優(yōu)點(diǎn)：熒光亮度增強(qiáng)， 提高了敏感度,四、非特異性染色的消除方法 1、非特異性染色的主要因素 1）部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。 2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分非特異結(jié)合。 3）組織內(nèi)類屬抗原的存在。 4）從

11、組織中難以提純抗原性物質(zhì)。 5）抗體分子上標(biāo)記的熒光素太多。 6）熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)。 7）細(xì)胞和組織內(nèi)某些物質(zhì)自發(fā)熒光。 8）染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度過(guò)高，沖洗不夠或標(biāo)本干燥,2、消除的方法 1）襯染法（可抑制自發(fā)熒光） 2）胰蛋白酶消化（可抑制非特異性熒光） 3）吸收（用小屬肝粉消除組織非特異性熒光的染色） 4）用正常（非免疫）血清（清除自發(fā)熒光和非特異性熒光） 5）提高抗體和熒光抗體的質(zhì)量,五、熒光顯微鏡及檢測(cè)方法 略 六、染色標(biāo)本的保存 原則上應(yīng)立即再熒光顯微鏡下觀察，拍照，此時(shí)熒光最強(qiáng)。 用緩沖甘油封片，保存在4中，過(guò)夜后特異性熒光強(qiáng)度減弱25，保存1周后減弱60,Nikon 熒光顯

12、微鏡,腎活檢（直接法,腎活檢（直接法,腎活檢（直接法） 低倍視野,腎活檢（直接法），表達(dá)弱,腎活檢（直接法,腎活檢（直接法,左圖：表達(dá)在細(xì)胞核（FITC,右圖：表達(dá)在胞膜,左圖：DAPI 染色（染核,右圖,胃粘膜上皮細(xì)胞，胞漿胞膜陽(yáng)性,血管內(nèi)彈力膜陽(yáng)性,胃腺癌,第三部分 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是免疫組織化學(xué)中最常見(jiàn)的方法之一，它是在抗原抗體特異性反應(yīng)存在的前提條件下，借助于酶學(xué)細(xì)胞化學(xué)手段，檢測(cè)某種物質(zhì)（抗原/抗體）組織細(xì)胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù),第一節(jié) 免疫組織化學(xué)的基本技術(shù) 一、取材 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 麻醉 （處死），鋒利刀片切成大小適中，厚度3mm4mm。 小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：灌注

13、（流）固定后取材 （生理鹽水和4多聚甲醛） 2.人體材料 活檢組織、手術(shù)標(biāo)本、細(xì)胞和組織,二、固定 原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測(cè)抗原的前提下，應(yīng)采用 濃度最低的固定劑和最短的固定時(shí)間，固定時(shí)間一般為112h。 1.常用的固定劑 （1）甲醛緩沖液 廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定，甲醛在很好地保護(hù)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時(shí)也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯(lián)作用會(huì)影響被固定細(xì)胞膜的通透性不利于染色時(shí)抗體的滲透，因此染色前常用酶進(jìn)行消化以使抗原決定簇充分暴露，固定時(shí)間不直超過(guò)24h,2）4多聚甲醛磷酸緩沖液 廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究。 （3）戊二醛多聚甲醛緩沖液 適用于光鏡、電鏡免疫組織化學(xué)研究。 （4）

14、其它 如PLP液（過(guò)碘酸賴AA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 類、鋨酸等,2.固定注意事項(xiàng) （1）固定液的選擇標(biāo)準(zhǔn)：A. 組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好。 B. 最大限度保存抗原的抗原性。 （2）組織塊的大小：1.5cm1.5cm0.5cm為宜。 （3）固定時(shí)間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成反比。 （4）溫度：一般在室溫下進(jìn)行，電鏡標(biāo)本和固定時(shí)間較長(zhǎng)時(shí) 可放置在4冰箱。 （5）固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑,三、包埋 1.石蠟包埋 2.冷凍包埋 3.環(huán)氧樹(shù)脂包理 四、切片 1.載玻片的處理 （1）清洗 （2）涂膠（防止脫片）。常用粘附劑： 明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠。樹(shù)脂膠：也稱白膠。 多聚賴氨酸

15、（PLL）。商品化粘附劑,2.切片類型 （l）石蠟切片 厚約3 5m，放置37溫箱烘烤過(guò)夜，以減少脫片。 （2）冷凍切片：2m。 （3）振動(dòng)切片：特點(diǎn)是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在載物臺(tái)上即可切片。切片較厚，可將陽(yáng)性部位作電鏡包埋。神經(jīng)組織應(yīng)用較多,第二節(jié) 免疫組化染色過(guò)程中基本技術(shù) 一、蛋白酶消化技術(shù) 進(jìn)行固定時(shí)，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定簇充分暴露出來(lái)，并使組織的通透性增高，以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強(qiáng)特異性染色。 1.常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶 2.消化時(shí)間 因組織而異，一般為530min，消化時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以

16、免損傷組織形態(tài)，破壞抗原決定族。消化結(jié)束后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶,3.非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過(guò)程中凡不屬于特異性抗原抗體反應(yīng)所出現(xiàn)的染色。 （1）原因分析 組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶或堿 性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等. 試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過(guò)量等。 （2）消除方法 加1抗前加正常血清1030min，以封閉組織中帶電荷的基因，避免與1抗的非特異性結(jié)合,減少非特異性染色： a.免疫酶組化染色時(shí)，在加1抗前，用0.3%的H2O2甲醇溶液將組織切片處理30min（3%的H2O2甲醇溶液處理510min）。 b.免疫熒

17、光染色時(shí)，可用0.010.05伊文思藍(lán)稀釋熒光抗體。 二、對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照片：用已知抗原為陽(yáng)性的標(biāo)本作對(duì)照 陰性對(duì)照片：確認(rèn)不含己知抗原的標(biāo)本作對(duì)照,三、抗體的分裝、稀釋、滴加及保存 1.抗體的分裝 不能用完的抗體分裝在小的EP管內(nèi)，保存在-20-40的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效。 2.抗體稀釋 常用0.01MPBS（磷酸緩沖溶液）或BSA（牛血清白蛋白） 3.滴加 滴加抗體要充分覆蓋組織切片，一般加 3050L,最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈,以防溶液的擴(kuò)散。 4.保存 未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長(zhǎng)期保存,四、免疫酶組織化

18、學(xué)技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù) 1.免疫酶染色原理 用酶作為標(biāo)記物，可分為直接法、間接法、補(bǔ)體法、免 疫酶橋法、免疫酶雙橋法、過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法 （PAP法）和雙PAP法等。 （1）直接法原理：用酶直接標(biāo)記在特異性1抗上，與標(biāo)本中的 抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗 原抗體反應(yīng)部位，即可在鏡下對(duì)標(biāo)本的抗原進(jìn)行檢測(cè)。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)；缺點(diǎn)：敏感性差,2）間接法原理：先用標(biāo)記的特異性1抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié)合，再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體（2抗）孵育，然后再加 酶的底物，顯示抗原抗體抗原抗體復(fù)合物存在的部 位，以對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)。 如：1抗是由兔產(chǎn)生的多克隆抗體,則2抗常用羊抗兔I

19、gG； 1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體,則2抗常用羊或馬抗鼠IgG。 以上兩種方法稱為酶標(biāo)抗體法 （3）非酶標(biāo)記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動(dòng)物，產(chǎn)生抗酶的抗體。通過(guò)酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。 常用的有PAP、sABC、LsAB法（附圖表說(shuō)明,酶標(biāo)識(shí)特異抗體,酶標(biāo)識(shí)二次抗體,生物素,HRP,ALP,2.常用的酶種類 底物 沉淀顏色 HRP A.3,3氨基聯(lián)苯胺DABH2O2 深褐色 B.5氨基水楊酸 H2O2 棕色 ALP A.苯酚磷酸鹽重氮鹽紅色 B.P校際酚磷酸鹽黃色 酸性磷酸酶 Gomoui液 葡萄糖氧化酶 D葡萄糖MTT酚嗪磷酸 甲酯化合物 藍(lán)色,第三節(jié)

20、 免疫組化的實(shí)際操作 1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（必須器材） （1）實(shí)驗(yàn)臺(tái)：光線充足，方便操作。 （2）濕潤(rùn)盒：放置抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)，避免干燥。 （3）微量移液器：120l,20200l,1001000l。 （4）其它：濾紙、紗布、吸頭、EP管、染缸、提籃等。 2.試劑藥品 （1）緩沖液：PBS,0.01 M磷酸緩沖液（pH7.2） TBS,0.05 M Tris鹽酸緩沖液（pH7.6） （2）抗體稀釋液: 1BSA或0.01 MPBS （3）102抗免疫動(dòng)物的正常血清 （4）DBAH2O2顯色液 （5）核復(fù)染液：蘇木素或甲基綠,3.sABC法的操作過(guò)程 基本原理：sABC（strepto-avidi

21、n-biotin peroxidase complex）鏈球菌抗生物素（卵白蛋）生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物 生物素(biotin):是一種分子量為244da的小分子的維生素。 抗生物素(avidin):是一種糖蛋白，分子量為68KDa。 生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過(guò)氧化物酶等相結(jié)合的能力。所以生物素-抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)及方便快速等顯著優(yōu)點(diǎn)。 附基本操作步驟,第四節(jié) 注意事項(xiàng)及結(jié)果判定 要想得到理想的結(jié)果，組織細(xì)胞形態(tài)的保存、抗原性的保存、充分的顯示是非常必要的。要滿足這些條件，取材、固定、切片厚度、

22、操作過(guò)程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、抗原修復(fù)及顯色等各程序的操作不當(dāng)均可導(dǎo)致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生,1. 取材固定 標(biāo)本要盡可能新鮮，取材固定要及時(shí)，固定液要新 鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。 2. 切片 切片不宜過(guò)厚，一般4m左右。切片不宜過(guò)大，載玻片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放37溫箱保存,3.脫蠟 脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯 5min3。 4.蛋白酶消化 由于組織在固定時(shí)抗原決定簇可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前常用蛋白酶處理組織切片（根據(jù)1抗要求），使抗原決定簇充分暴露出來(lái)，并使組織通透性增高，使抗體充分結(jié)合抗原，增強(qiáng)特異性染色。一般用0.1%胰蛋白酶

23、或胃蛋白酶消化530min。 5.抗原修復(fù) 一般在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液內(nèi)，微波爐，8595，10min左右,6.抗體的選擇 選擇抗體時(shí)要注意是用于冰凍切片還是用于石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說(shuō)明，是單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來(lái)源于哪種動(dòng)物，由此來(lái)選擇2抗；還有抗體的稀度（在實(shí)驗(yàn)前根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度。 7.特異性的確定 陰性對(duì)照（不加1抗，用PBS或TBS代替） 陽(yáng)性對(duì)照（已知確定陽(yáng)性的組織）或買陽(yáng)性對(duì)照片 顯色：注意H2O2的濃度，必須在顯示前加入H2O2均勻攪拌，最佳顯色時(shí)間在35min，過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都不會(huì)出現(xiàn)滿意的效果,9.復(fù)染 一般用蘇木素30s1min，過(guò)長(zhǎng)復(fù)染將

24、掩蓋免疫組化的染色效果。 10.結(jié)果判定 判斷是否陽(yáng)性或陰性，要排除假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。也要學(xué)會(huì)判斷特異性染色和非特異性染色。呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。 有關(guān)陽(yáng)性結(jié)果的定量判斷，常規(guī)的方法是根據(jù)呈色深淺和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分類計(jì)算，以（-）,+,+,+等分級(jí)和計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。 以下用圖片說(shuō)明,胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 cerbB-2癌基因表達(dá) sABC法,胃癌，P53抑癌基因表達(dá)， sABC法,胃癌CerbB-2的表達(dá)， sABC法,胃癌cerbB-2的淋巴管侵襲， sABC法,胃淋巴組織反應(yīng)性增生，CD20/CD43檢測(cè) sABC法,胃組織中的反應(yīng)性增生的淋巴組織，CD43表達(dá)，

25、 sABC法,IgAN，TGFs2表達(dá)，主要在近曲腎小管內(nèi)， sABC法,IgAN, TGFs2的表達(dá)，sABC法,IgAN，bFGF的表達(dá)， sABC法,IgAN, PDGF的表達(dá)， sABC法,骨骼肌營(yíng)養(yǎng)不良，myosin蛋白表達(dá)， sABC法,第五節(jié) 免疫組織化學(xué)在病理診斷中的應(yīng)用范圍 1.腫瘤診斷 未分化惡性腫瘤性質(zhì)判定；圓形、梭形、多形性腫瘤細(xì) 胞鑒別；轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位的確定。 2.淋巴瘤的診斷 鑒定反應(yīng)性增生疾病與淋巴瘤；各種淋巴瘤的分型。 3.內(nèi)分泌腫瘤的診斷（檢測(cè)腫瘤分泌的激素) 4.軟組織腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,5.小活檢組織病理檢查（能明確顯示瘤細(xì)胞存在與否) 6.微小癌、微

26、小轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)和骨髓) 7.細(xì)針穿刺（細(xì)胞學(xué)診斷) 8.部分腫瘤來(lái)源分類 9.乳腺癌激素受體檢測(cè)（ER，PR) 10.腫瘤基因產(chǎn)物（p53,cerb-B2,ALK,CDs) 11.增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定腫瘤的預(yù)后 12.病因診斷（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等,第六節(jié) 免疫組織化學(xué)在病理診斷中存在的不足 1.與分子生物學(xué)等技術(shù)相比，范圍有限 2.并非所有腫瘤均可以做免疫組化，因常無(wú)相應(yīng)的抗體 3.相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異性抗原的表達(dá)，同一種抗體，常 ?？杀磉_(dá)多種腫瘤 4.免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題,第四部分 免疫電子顯微鏡技術(shù) 一、免疫電鏡技術(shù)(immunoelecti

27、on microscopy) 是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法。從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原抗體的免疫反應(yīng)，必須使抗體帶上具有高電子密度的標(biāo)記物，這樣才能在電鏡下觀察反應(yīng)分結(jié)果。 到目前為止，已有三種標(biāo)記技術(shù)： (1)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù) (2)酶標(biāo)記技術(shù) (3)膠體金標(biāo)記技術(shù),二、免疫金標(biāo)記技術(shù)（immunogold staining technique) 用膠體狀態(tài)的金顆粒，作為抗體的標(biāo)記物，制成免疫膠體金來(lái)研究抗原抗體的反應(yīng)。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。電鏡下，金顆粒電子密度大，有利于超微結(jié)構(gòu)的觀察。 根據(jù)抗體特異性結(jié)合的原理，在亞細(xì)胞水平

28、定性定位。對(duì)抗體加以標(biāo)記，形成高電子密度區(qū)，在電鏡下觀察反應(yīng)過(guò)程。在對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標(biāo)記同一細(xì)胞內(nèi)不同的抗原。進(jìn)行多重標(biāo)記,三、免疫電鏡的基本技術(shù)方法 1.標(biāo)本的處理 (1)取材:各種培養(yǎng)細(xì)胞和分離的血細(xì)胞應(yīng)隨用隨??；游離的培 養(yǎng)細(xì)胞可先進(jìn)行離心；貼壁細(xì)胞可在載玻片上固定， 也可用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)；取組織塊時(shí)應(yīng)做到 越快越好，最好在沒(méi)有停止血流前取材,2）固定 固定液的選擇： 既要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，又要盡可能的保存抗原的活性。 A.多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液（PG固定液） B.過(guò)碘酸鹽賴氨酸多聚甲醛混合固定液（ PLP固定液） C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定

29、液（PAPG固定液) 固定方法與時(shí)間： A.血管灌注固定（最好方法） B.浸泡固定 C.微波固定,2.基本技術(shù)方法 （1）包埋前免疫電鏡技術(shù) 是指先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后進(jìn)行包埋、切片、觀察。 （2）包埋后免疫電鏡技術(shù) 是指組織標(biāo)本經(jīng)固定及樹(shù)脂包埋，制作成超薄切片后再進(jìn)行免疫化學(xué)染色方法。 詳見(jiàn)包埋前和包埋后電鏡技術(shù)的比較,包埋前與包埋后的比較,肝細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，可見(jiàn)G-6-P酶陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。 (32000,肝細(xì)胞。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)呈現(xiàn)琥珀酸脫氫酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒（36000）,IgAN, TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法,IgAN, TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法,K4M低溫

30、包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)聯(lián)合的免疫電鏡法 （實(shí)驗(yàn)結(jié)果介紹,免疫電鏡技術(shù)是從超微結(jié)構(gòu)水平能顯示抗原和抗體結(jié)合后在細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)水平的定位，這一技術(shù)已成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究手段。但是，由于免疫電鏡技術(shù)因多種原因造成的重復(fù)性差或技術(shù)的不穩(wěn)定性，加之目前電鏡包埋所采用的是環(huán)氧樹(shù)脂618或812，都需高溫聚合，這樣可使多種抗原活性減低或喪失。本研究組選用了Lowicryls K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)（SPI#17020），對(duì)免疫電鏡觀察的標(biāo)本進(jìn)行了處理，目的是更好的保存被檢測(cè)組織中抗原的活性，提高檢出率。現(xiàn)將一些不成熟的經(jīng)驗(yàn)和存在的問(wèn)題進(jìn)行一下總結(jié),一、紫外線低溫包埋機(jī)（SPI#17

31、020,SPI#17020是美國(guó)特殊研制的低溫包埋機(jī)，它最主要的特點(diǎn)是采用數(shù)字化溫度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在-10-37之間。通過(guò)溫度控制風(fēng)扇可以使機(jī)內(nèi)的溫度控制在某一恒定溫度，持續(xù)長(zhǎng)達(dá)36小時(shí)，完全可以滿足低溫脫水、浸透和包埋所需的時(shí)間。它占地面范圍小，但機(jī)內(nèi)空間較大，可以同時(shí)放入72個(gè)包埋膠囊。而且機(jī)箱上方有兩個(gè)封閉起來(lái)的波長(zhǎng)為360nm的紫外燈，低溫和室溫下的紫外線聚合都可以在包埋機(jī)中進(jìn)行。 總之，紫外線低溫包埋機(jī)是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機(jī)器,二、Lowicryls K4M 低溫包埋劑 Lowicryls K4M是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學(xué)物質(zhì)

32、，其特點(diǎn)是能在低溫下保持低粘度，能很快滲入組織以及具有在波長(zhǎng)360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無(wú)關(guān)，而且Lowicryls K4M具有親水性，因此它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色,三、方法 1.包埋劑的配制 商品提供的Lowicrys K4M包埋劑由三個(gè)部分組成：?jiǎn)误w，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下： （1）Lowicryls K4M：?jiǎn)误w 17.30g；交聯(lián)劑2.70g；引發(fā)劑0.10g。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒輕攪35分鐘。勿過(guò)分?jǐn)嚢?，以防空氣的氣泡進(jìn)入包埋劑中。

33、 （2）Lowicryls K4M的貯存：應(yīng)保存在暗處室溫下，該物質(zhì)有刺激性，在配制時(shí)應(yīng)戴手套，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應(yīng)立即以水沖洗局部,2.組織和細(xì)胞的取材、固定、處理 （1）組織的取材與固定：用銳刀將新鮮組織切成13mm3的小塊, 迅速置于3%多聚甲醛- 1%戊二醛固定液中, 23h。 （2）細(xì)胞的取材與固定：將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心15min，使細(xì)胞聚成團(tuán)塊，棄去上清夜，換上3%多聚甲醛1%戊二醛固定液固定23h,3）組織或細(xì)胞處理過(guò)程 將固定好的標(biāo)本用0.01mol/L 磷酸緩沖液沖洗, 10min3次；用0.5mmol/L N

34、H4CL-0.1mmol/L PB（pH7.4）封閉游離的醛基30min； 0.01mol/L 磷酸緩沖液1h；4 30%,50%乙醇脫水30min； -20乙醇系列逐級(jí)脫水至100%，各1h（乙醇溶液應(yīng)先在冰箱中預(yù)冷）。-20低溫包埋劑逐級(jí)滲透 , 純包埋劑浸透過(guò)夜。標(biāo)本放入含包埋劑的膠囊加蓋后放入紫外線低溫包埋機(jī)中，-20下用紫外線燈照射24h；室溫紫外線燈繼續(xù)照射34天，使樣品完全聚合固化。超薄切片厚度5070nm，展片后撈在覆有福爾馬膜的鑷網(wǎng)上,3.免疫染色 免疫標(biāo)記的切片用3%的H2O2 室溫下處理610min后，用0.01mmol/L PBS緩沖液沖洗10min3次。然后在1%BS

35、A-PBS封閉也上封閉30min，甩去不洗，滴加稀釋好的一抗（如果用來(lái)自植物或微生物的蛋白做探針，標(biāo)記溫度最好在25左右2060min；用來(lái)自動(dòng)物的蛋白做探針時(shí)，標(biāo)記溫度最好在30左右下2060min）。再次用0.01mmol/L PBS緩沖液漂洗和1%BSA-PBS封閉后用5nm膠體金IgG探針標(biāo)記60min，最后經(jīng)緩沖液沖洗，每次10min。陰性對(duì)照樣品在標(biāo)記前省卻一抗孵育步驟。標(biāo)記后的切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛各染色10min ,用JEM-122O透射電鏡下觀察,利用羊抗兔IgG膠體金探針對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行免疫金標(biāo)記，結(jié)果顯示在大鼠的肺泡壁內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)散在分布的金顆粒。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫