生技整理考試重點.doc

說明：1、資料中未按名詞解釋、簡答等的次序排版，如有需要，大家自行解決。2、有些細節(jié)，大家自己去看課件補充吧3、愿大家順利。一、基因工程本章總體思路1、生物技術：包括基因工程、細胞工程 、發(fā)酵工程 、酶工程 、蛋白質工程 2、基因工程：在體外對DNA進行切割、拼接, 使遺傳物質重新組合, 經載體轉移到細胞中擴增表達, 獲得人類所需產品, 或組建新生物類型的技術。3、基因工程誕生的理論基礎：DNA是遺傳物質；DNA雙螺旋結構；中心法則和遺傳密碼4、基因工程誕生的技術突破：DNA分子的體外切割與連接技術 DNA分子的核酸序列分析技術5、基因工程元年：1973年6、基因工程的特征：1. 跨物種性：外源基因到另一種不同的生物細胞內進行繁殖 2、無性擴增：外源DNA在寄主細胞內可大量擴增和高水平表達。 1.1 工具酶7、工具酶：（以下為常用工具酶）工 具 酶功 能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶 合成雙鏈cDNA分子或片段連接 缺口平移制作高比活探針 DNA序列分析 填補3末端反轉錄酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析（含義：以RNA為模板合成DNA的DNA聚合酶）多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3羥基末端進行同質多聚物加尾（1、探針標記2、在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進行連接）堿性磷酸酶切除末端磷酸基（制備載體時，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身連接）8、限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)：是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列, 并在合適的反應條件下使每條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產生具有3-OH基團和5-磷酸基團的DNA片段的內切脫氧核糖核酸酶。 分類: 包括限制性核酸內切酶、（基因工程技術中常用型） 作用：與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護自身DNA。9、平末端 (blunt end): DNA的兩條鏈在同一位置被切開，產生末端長度相等的DNA片段，即平末端。 粘末端(sticky end)：DNA分子的兩條鏈在不同的位置（中間隔2-4核苷酸）被切開，形成一條交錯的傷口，所得的DNA片段在末端都具有短的懸垂部分，即粘末端。10、同裂酶：來源不同的限制性內切酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同裂酶。同尾酶：有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。11、DNA連接酶的連接方式：1、粘性末端連接 2、平端連接 3. 末端修飾后進行連接 4. 人工接頭連接 1.2 載體(vector)12、載體：是指能在連接酶作用下和外源DNA片段連接，實現外源DNA的無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的DNA分子13、理想載體的基本條件： 1、可轉移性2、具有安全性3、合適的復制位點4、多克隆位點：廣泛、特異5、選擇標志，便于篩選和鑒定6、分子較小，可容納較大的外源DNA14、質粒：存在于細菌染色體外的小型共價閉合環(huán)狀DNA分子。 要求：含有復制起點；含有多克隆位點（MCS）；含有篩選標記； 高拷貝數；分子量??；易于導入宿主細胞15、T-克隆載體：5端帶一個不配對的堿基T，這樣的線性質?？蓪CR產物以TA配對連接的方式直接進行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的載體被稱為T-克隆載體 U-克隆載體：5端帶一個不配對的堿基U的線性質粒稱為U-克隆載體16、噬菌體克隆載體優(yōu)點： 其分子遺傳學背景十分清楚； 載體容量較大，能容納大約23kb的外源DNA片段； 具有較高的感染效率，其感染宿主細胞的效率幾乎可達100% 。 噬菌體分類;(1) 插入型載體（insert vector）：其限制酶位點可用于外源DNA的插入 (2) 取代型載體（replacement vector）：具有成對限制酶位點，外源DNA可取代兩個限制位點上的DNA區(qū)段。重組DNA與包裝蛋白混合，可在體外包裝成有感染力的重組噬菌體顆粒噬菌體應用：包裝范圍:36.4Kb-51.5kb 轉導效率:lg重組DNA分子獲得10 個以上的噬菌斑.用途:建立cDNA基因文庫,克隆外源目的基因。 17、酵母人工染色體(YAC) 把酵母染色體與基因復制和表達有關的主要組件都組裝在質粒上，令質粒行使酵母的轉錄功能和復制功能。 特點: 能容納長達 1000kb-3000kb的外源DNA片段用途: 構建基因組文庫，基因治療和基因功能鑒定。 18、表達載體（expressing vector） 表達載體是用來在受體細胞中表達外源基因的載體。表達載體常由克隆載體改造而來。 1.3 目的基因20、目的基因的獲取方法：（1）酶切法（限制性內切核酸酶酶切） ；（2）化學合成法（由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列） ；（3）cDNA文庫、基因組DNA文庫；（4）聚合酶鏈式反應（PCR）21、PCR引物設計原則：（1) 序列應位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-30 bp為宜。 (3) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm4(G+C)+2(A+T)；（4）堿基盡可能隨機分布。（5）引物內部避免形成二級結構。（6）兩引物間避免有互補序列。（7）引物3端為關鍵堿基；5端無嚴格限制22、PCR反應中的主要成份 1. 引物 2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP) 3. Mg2+ 4. 模板 5. Taq DNA聚合酶 6. 反應緩沖液 23、基因組DNA文庫：存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合24、cDNA文庫 將某種細胞的全部mRNA通過逆轉合成cDNA，然后轉化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群。25、基因的定位誘變 利用合成DNA和重組DNA技術，使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程，是基因工程和蛋白質工程的重要手段。用到的主要技術： 寡核苷酸指導的定位誘變 盒式誘變(cassette mutagenesis) PCR定位誘變 1.4 重組體的導入和鑒定26、作為理想宿主的基本要求 能高效吸收外源DNA分子不具有限制修飾系統(tǒng)應為重組缺陷型菌株根據載體類型選擇相應宿主根據載體標記選擇合適宿主具有安全性 27、常用的宿主細胞 1、大 腸 桿 菌： E.coli表達體系優(yōu)勢： （1）一種成熟的基因克隆表達的受體細胞 （2）繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制 （3） 易于進行遺傳操作和高效表達 2、 酵 母：優(yōu)勢：基因結構相對比較簡單，便于基因工程操作；培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產，成本低廉；外源基因表達產物能分泌到培養(yǎng)基中，便于產物的提取和加工；不產生毒素，是安全的受體細胞。 3、哺乳類動物細胞 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的缺點是，對組織細胞培養(yǎng)技術要求高，培養(yǎng)和篩選細胞株的周期長。 4、植物細胞28、外源DNA導入宿主細胞方法 外源DNA導入原核細胞外源DNA導入真核細胞轉化轉染感染酵母細胞哺乳動物細胞植物細胞CaCl2包裝蝸牛酶形成原生質體微量注射法電穿孔法磷酸鈣共沉淀法原生質體融合法精子介導法微量注射法電穿孔法農桿菌轉化基因槍法花粉管法植物轉基因常用方法： 1、.載體介導轉移系統(tǒng) 將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因導入植物細胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復制和表達。農桿菌Ti質粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri質粒(root-indcingplasmid)介導法是迄今為止植物基因工程中應用最多、機理最清楚、最理想的載體轉移方法。2、基因槍轟擊法 將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動力射入受體細胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達 3 花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉基因的新個體。 1.5、目的克隆的篩選與鑒定29、目的克隆的篩選 （1）抗生素抗性選擇法（2）插入失活法 （3）-半乳糖苷酶顯色反應法（藍白篩選）30、目的基因序列鑒定 （1）菌落原位雜交：是將細菌從培養(yǎng)平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。（2）限制性酶圖譜分析（酶切后，進行PCR，看是否有目的條帶） （3） DNA序列檢測（桑格 雙脫氧終止法）31、分子雜交技術Western blot（抗原抗體雜交） 原理及步驟：經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分 Southern 雜交 DNA片段經電泳分離后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為 DNA ，探針為 DNA 或RNA步驟：Northern 雜交 RNA 片段經電泳分離后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為 RNA，探針為 DNA 或 RNA步驟：二、氨基酸和蛋白質1、氨基酸等電點：在某一定PH溶液中，氨基酸所帶的正電荷和負電荷相等時的PH.2、蛋白質來源：重組 人工合成天然蛋白：產量少、成本高；不易分離純化；易受病原侵染重組蛋白：高表達量、成本低；高純度；安全。 獲得重組蛋白的一般方法：（1）離體細胞中表達；（2）轉基因植物或動物中表達 獲得重組蛋白的步驟：（1）分離目的基因 （2）目的基因連接到表達載體 （3）表達載體導入受體細胞 （4）通過發(fā)酵培養(yǎng)細胞 （5）分離、純化目的蛋白 （6）得到目的蛋白3、細菌表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點： 優(yōu)點：1、繁殖速度快 2、蛋白質產量高 3、易培養(yǎng)，花費少 4、儀器成本低 缺點：1、無法表達分子量大的蛋白質（50KD） 2、無法去除糖基或信號肽 3、真核生物的蛋白質對細菌可能有毒害作用 4、無法很好處理富含2S鍵蛋白質的S-S4、酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點： 優(yōu)點如上所述（第27題）+ （1）能表達分子量大的蛋白質（50KD） （2）能去除糖基或信號肽 （3）有伴侶蛋白能協(xié)助一些蛋白質的折疊 （4）能很好處理富含2S鍵蛋白質的S-S5、病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點： 缺點：（1）生長緩慢 （2）寄主細胞的培養(yǎng)只能持續(xù)4-5天 （3）表達系統(tǒng)的構建比較費時，不如酵母簡單 優(yōu)點：（1）能表達分子量大的蛋白質（50KD） （2）修正糖基和去除信號肽 （3）有伴侶蛋白能協(xié)助一些蛋白質的折疊 （4）產量非常高，成本低。 三、蛋白質的分離內容概要：一、Disruption of cells（細胞裂解）:Osmotic（滲透作用）Enzymatic（酶法）Mechanical（機械壓力法）二、Clarification（澄清）: Centrifugation（離心）Filtration（過濾）三、Concentration（濃縮）: Precipitation(沉淀 凝聚)Ultra filtration（超濾）1、蛋白質提純的方法及原理 （一）鹽析 原理：蛋白質在水溶液中的溶解度取決于蛋白質分子表面離子周圍的水分子數目，以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質溶液中加入中性鹽后（主要用硫酸銨），由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。（二）柱層析法 分類 按層析的機理劃分： 吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。 分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數不同，使之分離。 離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。 凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 原理 離子交換層析 離子交換基團在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。 凝膠層析 凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了親和層析 親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結合，而這種結合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應抗體（或抗原）選擇性地結合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質分開，達到分離提純的目的。疏水作用層析 蛋白質表面一般有疏水與親水基團，疏水作用層析是利用蛋白質表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時結合。在洗脫時，將鹽濃度逐漸降低，因其蛋白質疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化，可用于分離其它方法不易純化的蛋白質 基本原理如圖所示： L+HSLHS+WP：固相支持物L：疏水性配體S：蛋白質或多肽等生物大分子H：疏水補丁W：溶液中水分子P沒有活性蛋白的提純方法（三）電泳 1、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度決定于蛋白質分子的大小，SDS是一種去垢劑，可以與蛋白質分子相結合，使其變性并帶上大量的負電荷，同時變成棒狀，從而掩蓋了蛋白質原有電荷和形狀的差異。蛋白質分子的遷移率與蛋白質相對分子質量的對數成直線關系。根據樣品的遷移率不同，可以將不同中蛋白質分開。SDS的作用：SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，其所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。 2、活力單位：在最適條件（25）下，每分鐘內催化1微摩爾（mol）底物轉化為產物所需的酶量定為一個活力單位 酶活力也稱為酶活性，是指酶催化一定化學反應的能力。 酶的比活力代表酶制劑的純度。指每毫克蛋白所含的酶活力單位數。對于同一種酶來說，比活力愈大，表示酶的純度愈高。 3：HPLC,即高壓液相色譜法，是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。FPLC全稱為快速蛋白液相色譜，其原理與高效液相色譜理論類似，是由經典的液體柱層析引入氣相色譜理論，并且對相體進行了改革，配用高壓輸液泵，采用高靈敏檢測器、梯度洗脫裝置、自動收集裝置和微機等發(fā)展起來的現代液相色譜. 四、蛋白質結構解析1、蛋白質結構鑒定的方法及其優(yōu)缺點： （一）X射線晶體衍射圖譜法 晶體X射線衍射是X射線在蛋白質晶體中發(fā)生的衍射現象。當X射線入射到晶體分子上時，晶體上的每個原子使射線發(fā)生散射，散射的波之間相互疊加發(fā)生衍射，衍射的結果隨蛋白質晶體結構的不同而有所不同，并以此來確定蛋白質的結構步驟：1、提純蛋白質 2、經過柱層析分離蛋白質 3、電泳 4、懸滴法使蛋白質結晶 5、X射線照射晶體，根據衍射圖譜分析蛋白質三維結構。優(yōu)點：分辨率高； 缺點：蛋白質結晶難（X射線晶體衍射要求蛋白質處于晶體狀態(tài)）；難以測定膜蛋白結構；要求蛋白質純度高。（二）核磁共振 處于某個靜磁場中的自旋核系統(tǒng)在收到一定頻率的射頻磁場作用時，共振吸收某一射頻頻率輻射，電子由基態(tài)躍遷激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就會釋放出射頻，被檢測器檢測而成像，根據成像確定蛋白質的結構步驟：1、13C和/或15N標記蛋白質 2、在水溶液中濃縮蛋白質 3、將樣品置于一定的外界磁場中，13C和15N原子核會發(fā)生自旋產生的磁場與外界磁場相