常用試劑與培養(yǎng)基.doc

第九章 微生物實(shí)驗(yàn)室常用試劑與培養(yǎng)基 第一節(jié) 常用試劑及其使用方法一、診斷用紙片1.桿菌肽紙片（0.04U/片），抑菌圈10mm為敏感。質(zhì)控菌株 A群鏈球菌陽(yáng)性 D群鏈球菌陰性 2.SMZ紙片（1.25g/23.75g/片），出現(xiàn)抑菌圈即為敏感。質(zhì)控菌株 D群鏈球菌陽(yáng)性 A群鏈球菌陰性 3.新生霉素紙片（5.0g/片），抑菌圈16mm為敏感。質(zhì)控菌株 表皮葡萄球菌陽(yáng)性 腐生葡萄球菌陰性 4.O129紙片、奧普托欣（Optochin）紙片參見(jiàn)第五節(jié)生化試驗(yàn)培養(yǎng)基。二、診斷用血清1.沙門菌屬診斷血清A-F群O多價(jià)血清特異O群因子血清 常用的有O2，O4，O7，O9，O10特異H因子血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子血清。 2.志賀菌屬診斷血清 志賀菌屬四種多價(jià)血清（含有痢疾志賀、福氏、宋內(nèi)志賀） 痢疾志賀菌、血清。 福氏志賀菌多價(jià)血清及分型血清（1-6型）。 宋內(nèi)志賀菌診斷血清（除光滑相抗血清外，能制備粗糙相抗血清）。 鮑氏志賀菌多價(jià)血清及分型血清。3.致病性大腸埃希菌診斷血清腸致病性大腸埃希菌（EPEC）診斷血清。產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（ETEC）診斷血清。腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）診斷血清。腸出血性大腸埃希菌（EHEC）診斷血清O157：H7。 4.霍亂弧菌O1、O139混合多價(jià)診斷血清及稻葉、小川、彥島O139分型血清。 5.腦膜炎奈瑟菌多價(jià)血清及分群血清。 6.鏈球菌分類診斷血清。 7.肺炎鏈球菌診斷血清。8.耶爾森菌診斷血清。三、常用染色液(一)革蘭染色液1. 結(jié)晶紫溶液A液 結(jié)晶紫 20g 95%乙醇 20mlB液 草酸銨 0.8g蒸餾水 80ml需在用前24小時(shí)將A液. B液混合,過(guò)濾后裝入試劑瓶?jī)?nèi)備用。2.碘液 碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水 300ml將碘與碘化鉀混合并研磨,加入幾毫升水, 使其逐漸溶解,然后研磨,繼續(xù)加入少量蒸餾水至完全溶解。最后補(bǔ)足水量。也可用少量蒸餾水將碘化鉀完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。3.脫色液 95%乙醇4.復(fù)染液A貯存液 沙黃 2.5g 95%乙 100mlB應(yīng)用液:A液 10ml蒸餾水 90ml(二)抗酸染色液1堿性復(fù)紅染色液(1)萋納石炭酸復(fù)紅溶液堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液 10ml5%石炭酸溶液 90ml(2)脫色液濃鹽酸 3ml95%乙醇 97ml(3)復(fù)染液(呂弗勒美藍(lán)液)美藍(lán)乙醇飽和溶液 30ml100g/L氫氧化鉀 0.1ml蒸餾水 100ml2.金胺0-羅丹明B染色液(1) 羅丹明B液 羅丹明B0.1g加蒸餾水100ml。(2)1g/L金胺O液 金胺O液0.1g加蒸餾水95ml,再加入純石炭酸 5ml,混勻。(3)3%鹽酸酒精(4)稀釋美藍(lán)液 呂弗勒美藍(lán)液100ml,加蒸餾水90ml,混勻。(三)鞭毛染色液(改良Ryu法)A液 5%石炭酸 10ml鞣酸 2g飽和硫酸鋁鉀液 10mlB液 結(jié)晶紫酒精飽和液 應(yīng)用液A液10份,B液1份,混合,室溫存放備用。(四)異染顆粒染色液甲液 甲苯胺藍(lán) 0.15g孔雀綠 0.2g95% 乙醇 2.0ml蒸餾水 100ml乙液 碘 2g 碘化鉀 3g 蒸餾水 300ml先將碘化鉀加入少許蒸餾水(約2ml),充分振搖,待完全溶解,再中入碘,使完全溶解后, 加蒸餾水至300ml。(五)莢膜染色液1印度墨汁或50g/L黑色素水溶液25g/L苯胺蘭水溶液第二節(jié) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基一、液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基(一)蛋白胨水(Peptone water)用途 1.供細(xì)菌靛基質(zhì)試驗(yàn)用。 2.一般細(xì)菌培養(yǎng)和傳代。 配法 蛋白胨（或胰蛋白胨） 10g Nacl 5g 蒸餾水 1L pH 7.2 將上述成分溶于水中，校正pH,分裝試管，每管23ml，置121滅菌15min備用。 質(zhì)量控制大腸埃希菌 生長(zhǎng)良好，靛基質(zhì)陽(yáng)性；傷寒沙門菌 生長(zhǎng)良好，靛基質(zhì)陰性。(二)營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient broth)用途 供一般細(xì)菌的增菌培養(yǎng)，加入1%的瓊脂粉亦可作營(yíng)養(yǎng)瓊脂。配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3gNacl 5g蒸餾水 1LpH 7.4 將上述成分稱量混合溶解于水中，校正pH，按用途不同分裝于燒瓶或試管內(nèi)。經(jīng)121滅菌15min，作無(wú)菌試驗(yàn)后冷藏備用。 質(zhì)量控制 金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、化膿性鏈球菌 生長(zhǎng)良好。保存 置冰箱3周內(nèi)用完。 (三)牛肉浸液培養(yǎng)基 用途 細(xì)菌培養(yǎng)最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，除用于一般細(xì)菌的培養(yǎng)外，又可以作營(yíng)養(yǎng)瓊脂及其它培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。 配法 新鮮除脂牛肉 500g Nacl 5g 蛋白胨 10g 蒸餾水 1L pH 7.47.6 1.先將牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切塊絞碎。稱取500g置容器加入蒸餾水1L，攪勻后置冰箱過(guò)夜，次日煮沸加熱30min，并用玻棒不時(shí)攪拌用絨布或麻布進(jìn)行粗過(guò)濾，再用脫脂棉過(guò)濾即成。在過(guò)濾中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g溶解后，用NaOH溶液矯正pH至7.67.8，并加熱煮沸10min，補(bǔ)充蒸餾水至1L，最后用濾紙過(guò)濾，呈清晰透明、淡黃色液體，經(jīng)12115min滅菌備用。 2.根據(jù)用途不同可以制成營(yíng)養(yǎng)肉湯，以此為基礎(chǔ)制成其它培養(yǎng)基。如制作固體培養(yǎng)基，加入瓊脂15g/L20g/L即可。質(zhì)量控制 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌等均生長(zhǎng)良好。 保存 置4冰箱內(nèi)可以使用較長(zhǎng)時(shí)間。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量為3g/L5g/L。二、固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (一)營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient agar) 用途 供一般細(xì)菌和菌株的純化及傳種用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g Nacl 5g 瓊脂粉（優(yōu)質(zhì)） 12g 蒸餾水 1L pH 7.27.4 將上述成分(除瓊脂外)溶于水中，校正pH后加入瓊脂，煮沸溶解，根據(jù)用途不同進(jìn)行分裝，經(jīng)121滅菌15min，傾注平板或制成斜面，冷藏備用。 質(zhì)量控制 金黃色葡萄球菌 菌落淺黃色； 痢疾志賀菌 菌落無(wú)色；銅綠假單胞菌 菌落無(wú)色或淺綠色。保存 置4冰箱保存，兩周內(nèi)用完。 (二)血瓊脂培養(yǎng)基(Blood agar medium) 用途 供一般病原菌的分離培養(yǎng)和溶血性鑒別及保存菌種用。配法 pH7.47.6牛肉浸液瓊脂 100ml 脫纖維羊血(或兔血) 510ml 將血瓊脂基礎(chǔ)經(jīng)121滅菌15min，待冷卻至50左右以無(wú)菌手續(xù)加入羊血，搖勻后立即傾注滅菌平皿內(nèi)，待凝固后，經(jīng)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)冷藏備用。 質(zhì)量控制 化膿性鏈球菌ATCC 19615生長(zhǎng)良好，-溶血；肺炎鏈球菌ATCC 6303生長(zhǎng)良好，-溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生長(zhǎng)良好,不溶血。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 (三)巧克力瓊脂培養(yǎng)基 用途 主要用于嗜血桿菌的分離培養(yǎng)，亦可用于奈瑟菌的增殖培養(yǎng)。 配法 鮮牛肉浸出液 1L蛋白胨 10g Nacl 5g 瓊脂粉 12g 無(wú)菌脫纖維羊血或兔血 100ml 將上述成分（除兔血外）加熱溶解，調(diào)pH7.2，置12115min高壓滅菌，待冷至約85，以無(wú)菌方法加入兔血，搖勻后置85水浴中，維持該溫度10min，使之成巧克力色。取出置室溫冷至約50，傾注平板或制成斜面?zhèn)溆谩?質(zhì)量控制 流感嗜血桿菌ATCC 10211、肺炎鏈球菌ATCC 6305生長(zhǎng)良好，菌落典型。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 (四)胱氨酸胰化酪蛋白瓊脂（CTA）用途 常用于測(cè)定腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及營(yíng)養(yǎng)要求較高細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)。 配法 胱氨酸 0.5g 胰化酪蛋白 20g NaCl 5g 亞硫酸鈉 0.3g 瓊脂 3.5g 酚紅 0.0175g 蒸餾水 1L 將上述成分（酚紅除外）混合溶解，調(diào)pH至7.2，加入酚紅指示劑。分裝試管，11515min滅菌。用于測(cè)定糖發(fā)酵時(shí)，按需要加入各種糖溶液，將待檢標(biāo)本直接種于培養(yǎng)基管內(nèi)，置35孵箱，18h24h觀察結(jié)果。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色為陽(yáng)性，不變色為陰性。第三節(jié) 保存和增菌培養(yǎng)基一、菌種保存培養(yǎng)基 (一)皰肉培養(yǎng)基(Chopped meat medium) 配法 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液（pH7.6） 7ml 將干燥的肉渣0.5克裝入15mm150mm試管內(nèi)，再加入pH7.6牛肉浸液7ml，兩者高度比例為12。在試管液面上加一層34mm高度的融化凡士林，用橡皮塞塞緊，經(jīng)121滅菌15min后，置4冰箱備用。質(zhì)量控制破傷風(fēng)桿菌或壞死梭桿菌48h的培養(yǎng)物，稀釋1000倍，每管接種0.01ml，生長(zhǎng)良好。保存置4冰箱內(nèi)，數(shù)月有效。(二)半固體培養(yǎng)基(Semi-solid medium) 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 3g Na2HPO412H2O 2g 瓊脂粉 4.5g 蒸餾水 1L pH 7.47.6 將上述成分混合于水中，加熱溶解，調(diào)pH至7.47.6，分裝試管內(nèi)的2/3左右的高度，12115min高壓滅菌，備用。 質(zhì)量控制 大腸埃希菌(ATCC25922)生長(zhǎng)良好,動(dòng)力陽(yáng)性。 福氏志賀菌(ATCC12022)生長(zhǎng)良好,動(dòng)力陰性。 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)生長(zhǎng)良好,動(dòng)力陰性。培養(yǎng)基呈淡黃色半固體狀。二、增菌培養(yǎng)基(enrichment medium) (一)葡萄糖肉湯 用途 用于血液增菌。 配法 蛋白胨(或月示 胨) 10g NaCl 5g 肉浸液（或心浸液） 1L 葡萄糖 3g 枸櫞酸鈉 3g 5g/L對(duì)氨基苯甲酸水溶液 10ml 1mol/L MgSO47H2O 20ml 青霉素酶 1000U 將蛋白胨、NaCl混合于肉浸液中加熱溶解，再加入葡萄糖、枸櫞酸鈉、對(duì)氨苯甲酸及硫酸鎂，繼續(xù)煮沸5min，并補(bǔ)足失水，調(diào)整pH至7.8。過(guò)濾分裝，每瓶50ml，高壓滅菌11520min后，每瓶加入青霉素酶50U，經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)合格后，冷卻備用。 將采取的血液標(biāo)本，以無(wú)菌手續(xù)注入培養(yǎng)瓶中（血液1ml，培養(yǎng)液10ml），置35培養(yǎng)箱內(nèi)，每日取出觀察一次結(jié)果。如有細(xì)菌生長(zhǎng)，可出現(xiàn)數(shù)種不同的表現(xiàn)，應(yīng)隨時(shí)作分離培養(yǎng)，可選用血瓊脂、EMB及巧克力平板等。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)的培養(yǎng)瓶，需連續(xù)觀察7天，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)方可棄去。在觀察的過(guò)程中，至少應(yīng)作兩次分離培養(yǎng)。注:1.枸櫞酸鈉為抗凝劑，使血液加入培養(yǎng)基中不凝固。 2.對(duì)氨基苯甲酸主要能中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。 3.硫酸鎂主要能破壞血液中存在的四環(huán)素、金霉素、新霉素、多粘菌素及鏈霉素的抑菌作用。4.本培養(yǎng)基近年來(lái)有許多改良配方，如加入0.3%0.5%酵母浸膏以增加營(yíng)養(yǎng)；加0.2%核酸刺激細(xì)菌生長(zhǎng)；加0.1%粘液素能被覆于細(xì)菌的表面，保護(hù)細(xì)菌免受抗體破壞；加入聚茴香腦磺酸鈉（SPS）能中和補(bǔ)體抗藥作用提高檢出率。 (二)血液增菌培養(yǎng)基(Blood enriched medium) 用途 供血液和骨髓液病原菌的增菌培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 10g Nacl 5g 牛肉膏 3g 葡萄糖 1g 酵母膏粉 3g 枸櫞酸鈉 3g K2HPO4 2g 5g/L對(duì)氨基苯甲酸 5ml 1mol/LMgSO4。7H2O 20ml 4g/L酚紅溶液 6ml 青霉素酶 50U 聚茴香腦磺酸鈉(SPS) 0.3g 蒸餾水 1L pH 7.4 將上述成分（除酚紅指示劑、青霉素酶外）混合加熱溶解，校正pH至7.4，再加酚紅，過(guò)濾分裝每瓶3050ml，經(jīng)121滅菌15min經(jīng)3524h無(wú)菌試驗(yàn)備用。臨用時(shí)每瓶加入1.52.5U青霉素酶。質(zhì)量控制 傷寒沙門菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化膿性鏈球菌ATCC 19615、肺炎鏈球菌ATCC 6305、金黃色葡萄菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853均生長(zhǎng)良好。 (三)亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基(SF)（Selenite enrichment medium） 用途 供沙門菌增菌培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 5g 乳糖 4g 磷酸氫二鈉 4.5g 磷酸二氫鈉 5.5g 亞硒酸氫鈉 4g 蒸餾水 1L pH 7.07.1 先將亞硒酸鹽加到200ml蒸餾水中，充分搖勻溶解。其它成分稱量混合，加入蒸餾水800ml，加熱溶解，待冷卻后兩液混合，充分搖勻，校正pH7.07.1(調(diào)整磷酸鹽緩沖對(duì)的比例來(lái)校正pH值)。最后分裝于15mm150mm的試管內(nèi)，每管10ml。置水浴隔水煮沸10min15min，立即冷卻，置4冰箱保存?zhèn)溆谩?取新鮮便例標(biāo)本1g或棉拭子采樣直接種于該培養(yǎng)管內(nèi)。搖動(dòng)后置35培養(yǎng)過(guò)夜，如發(fā)現(xiàn)均勻混濁，管底有紅色沉淀物，表示細(xì)菌生長(zhǎng)。然后取培養(yǎng)物分離在選擇性培養(yǎng)基上，如SS瓊脂、HE瓊脂或麥康凱平板等，進(jìn)行培養(yǎng)。質(zhì)量控制培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色或無(wú)色，透明無(wú)沉淀物。增菌靈敏度 傷寒沙門菌110-5，鼠傷寒及副傷寒沙門菌110-7。保存 4保存，1周內(nèi)用完。 注：1.亞硒酸鹽，包括亞硒酸鈉、亞硒酸氫鈉、原則上均可使用。但以亞硒酸氫鈉效果為好。 2.磷酸鹽緩沖對(duì)，兩者的用量比例與含量和亞硒酸鹽及蛋白胨的品種有關(guān)。制備前應(yīng)進(jìn)行調(diào)試，其總量為10g/L。 3.在制備過(guò)程中，亞硒酸鹽不能直接加熱。隔水煮沸時(shí)間亦不能超過(guò)規(guī)定時(shí)間，否則亞硒酸鹽會(huì)變質(zhì)，生成紅色沉淀物，而降低抑制性。4.培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色，有紅色沉淀物出現(xiàn)時(shí)不可再用。 (四)SS增菌液(Salmonella Shigela Enrichment Broth) 用途 用于沙門、志賀菌的增菌。 配法月示 胨 2g蛋白胨 8g 牛肉膏 3.5g 酵母膏 2g 葡萄糖 2g 枸櫞酸鐵 10g 硫代硫酸鈉 10g 亞硫酸鈉 0.7g 膽鹽 5.5g Na2HPO4 4g KH2PO4 0.1g 去氧膽酸鈉(進(jìn)口) 1.5g煌綠 0.005g 蒸餾水 1L pH 7.1 將上述成分加熱溶于水中，分裝試管（150mm15mm），每管57ml，隔水煮沸5min備用。 取病人糞便標(biāo)本1g直接種于增菌液內(nèi)，3516h18h培養(yǎng)，取出分離平板即可。 質(zhì)量控制 培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色或略呈淡綠色。傷寒沙門菌ATCC50096,福氏志賀菌ATCC12022 生長(zhǎng)良好；大腸埃希菌ATCC25922 抑制生長(zhǎng)。 注：1.切勿高壓，隔水煮沸時(shí)間不宜超過(guò)5min。 2.煌綠用量應(yīng)根據(jù)不同批號(hào)酌情增減。 (五)堿性蛋白胨水(Alkaline peptone water) 用途 供霍亂弧菌增菌培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 蒸餾水 100ml pH 8.6 將上述成分溶解于水中,校正pH，分裝于試管810ml，經(jīng)12115min滅菌備用。 將待檢標(biāo)本接種到堿性胨水中，置35培養(yǎng)6h8h，取表面菌液一白金環(huán)移種到堿性瓊脂、慶大瓊脂或TCBS瓊脂平板上。必要時(shí)做第二次增菌。（經(jīng)6h8h培養(yǎng)，霍亂弧菌呈均勻混濁生長(zhǎng)，表面有菌膜出現(xiàn)。）質(zhì)量控制 各實(shí)驗(yàn)室自配或采用商品培養(yǎng)基，用前有條件的實(shí)驗(yàn)室可用標(biāo)準(zhǔn)菌株，一般臨床實(shí)驗(yàn)室可用非01群弧菌，生長(zhǎng)良好者方可使用?；魜y弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌 生長(zhǎng)良好（6h）；大腸埃希菌ATCC25922 不生長(zhǎng)（6h）。保存 置4冰箱，2周內(nèi)用完。注：若在堿性胨水中加入1%亞碲酸鉀0.51ml/L，則成為亞碲酸鉀堿性胨水，其增菌效果更為理想。第四節(jié) 分離培養(yǎng)基 一、革蘭陽(yáng)性桿菌分離培養(yǎng)基 (一)羅-琴改良培養(yǎng)基（Lowenstein-Jenden medium）用途 供結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)用。 配法 KH2PO4 2.4g MgSO47H2O6 0.24g 枸櫞酸鎂(或枸櫞酸鈉) 0.6g 天門冬素 3.6g 甘油(純) 12ml 蒸餾水 600ml 馬鈴薯淀粉 30g 新鮮雞卵液 1L 2%孔雀綠水溶液 20ml 先將磷酸鹽、硫酸鎂、枸櫞酸鎂、天門冬素及甘油，加熱溶解于600ml蒸餾水中。再添放馬鈴薯粉，邊放邊攪，并繼續(xù)置沸水中加熱30min，待冷卻至60左右時(shí)，加入雞卵液1L及孔雀綠溶液20ml，充分混勻后，用無(wú)菌操作分裝于滅菌試管，每支56ml，塞緊橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器內(nèi)制成斜面，經(jīng)851h間歇滅菌二次(或高壓滅菌11520min)，待凝固后經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)，4冷藏備用。 取晨咳痰或其它體液標(biāo)本，經(jīng)消化處理和離心沉淀的濃縮液0.1ml（約二滴）滴種于培養(yǎng)基的斜面上，盡量搖晃，置355%10%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)14周，觀察結(jié)果。凡在1周內(nèi)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)的菌落，一般不可能是結(jié)核分枝桿菌；在2周后生長(zhǎng)的菌落，呈奶油狀，略帶黃色，粗糙突起，不透明，即取菌進(jìn)行涂片染色鏡檢，及作其鑒定。質(zhì)量控制 自制或商品培養(yǎng)基在使用前，均應(yīng)進(jìn)行性能監(jiān)測(cè)，符合要求者方可應(yīng)用。保存置4冰箱內(nèi)24周有效。 注：1.本培養(yǎng)基pH約為6.0左右，一般無(wú)須校正。 2.間歇滅菌的溫度不宜超過(guò)90。 (二)血清斜面培養(yǎng)基(呂氏血清斜面) 用途 供白喉棒狀桿菌培養(yǎng)用。配法1%葡萄糖肉湯(pH7.6) 100ml 無(wú)菌動(dòng)物血清(牛羊豬兔) 300ml 將上述成分混合后，分裝于試管內(nèi)，每管約45ml。斜插在血清凝固器內(nèi)（或蒸籠）加熱808530min，使血清凝固成斜面，冷卻后放4冰箱內(nèi)。取出后采用間歇滅菌法，85滅菌30min，連續(xù)3天，經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)證明無(wú)雜菌生長(zhǎng)即可應(yīng)用。 將喉拭直接接種于上述斜面上，置35培養(yǎng)16h24h。白喉?xiàng)U菌在上述培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，表面光滑、完整，鹽水中易乳化，用阿爾培脫染色，兩極異染顆粒明顯。 注：1.所用血清不能含有防腐劑。 2.該培養(yǎng)基不能高熱滅菌，以防破壞其營(yíng)養(yǎng)成分。3.配制時(shí)所有器皿、棉塞等均應(yīng)高壓滅菌。 (三)亞碲酸鉀血瓊脂 用途 分離白喉?xiàng)U菌用 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉浸膏 3g 葡萄糖 2g 胱氨酸 0.05g 1%亞碲酸鉀 45ml 脫纖維羊血 100ml 瓊脂 2g 蒸餾水 900ml pH 7.6 先將蛋白胨、NaCl、牛肉膏、葡萄糖和胱氨酸加水加熱溶解，調(diào)pH至7.6，加入瓊脂，高壓滅菌11515min備用。待冷至50左右，用無(wú)菌操作加入已滅菌的亞碲酸鉀溶液及羊血，混勻傾注平板。將標(biāo)本直接接種于亞碲酸鉀平板上。置35孵箱，經(jīng)24h48h培養(yǎng)，觀察結(jié)果。白喉?xiàng)U菌能使亞碲酸鉀還原成金屬碲而形成黑色和灰黑色的菌落。其它大部分細(xì)菌在此培養(yǎng)基上被抑制，故較易鑒別。 二、革蘭陰性桿菌分離培養(yǎng)基 (一)弧菌分離培養(yǎng)基 1.堿性瓊脂 用途 供霍亂弧菌分離培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 脂 20g 蒸餾水 1L pH 8.4 將上述成分混合于水中，加熱溶解，校正pH至 8.4，分裝后高壓滅菌12115min傾注平板。 凡急性病人水樣便在做增菌培養(yǎng)的同時(shí)，應(yīng)直接取標(biāo)本接種到堿性瓊脂平板或亞碲酸鉀瓊脂平板上。置35培養(yǎng)12h16h，觀察結(jié)果?；魜y弧菌生長(zhǎng)較快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑濕潤(rùn)。在亞碲酸鉀瓊脂上菌落呈灰黑色。質(zhì)量控制 各實(shí)驗(yàn)室凡自配或商品培養(yǎng)基,在使用前有條件的實(shí)驗(yàn)室可用標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)對(duì)照，臨床實(shí)驗(yàn)室可送防疫部門所設(shè)立的專門檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行目的菌監(jiān)測(cè),質(zhì)量可靠者方可使用.EL-Tor弧菌 生長(zhǎng)良好；大腸埃希菌ATCC 25922 抑制生長(zhǎng)。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 2.堿性膽鹽瓊脂(Alkaline bile-salt agar） 用途 用于霍亂弧菌的分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 5g10g 瓊脂 20g 膽鹽（牛、豬） 2.5g 蒸餾水 1L pH 8.4 將上述成分稱量混合于水中加熱溶解，校正pH，分裝高壓滅菌12115min，傾注平板。 取病人糞便標(biāo)本或增菌培養(yǎng)物1接種環(huán)接種平板，置35溫箱培養(yǎng)16h18h?；魜y弧菌迅速生長(zhǎng)，其它細(xì)菌生長(zhǎng)較緩慢。在16h18h，霍亂弧菌的菌落較大，直徑可達(dá)2mm左右。呈扁平，青灰色，半透明，光滑濕潤(rùn)，易挑起。其它細(xì)菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。質(zhì)量控制 同堿性瓊脂。保存 置冰箱，1周內(nèi)用完。 3.慶大霉素瓊脂(Gentamicin Agar) 用途 供霍亂弧菌分離培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g 枸櫞鈉 10g 無(wú)水亞硫酸鈉 3g 蔗糖(或白糖) 10g 瓊脂 15g20g 慶大霉素,多粘菌素B“雙抗液” 2ml 蒸餾水 1L pH 8.4 將上述成分(除雙抗液外)稱量混合于水中，加熱溶解，校正pH，分裝滅菌12115min，待冷卻至50后，每100ml內(nèi)加“雙抗液”0.2ml，另加5g/L亞碲酸鉀水溶液0.1ml，再傾注平板。最后每ml培養(yǎng)基內(nèi)含有慶大霉素0.5U，多粘菌素B6U。 將糞便標(biāo)本或增菌培養(yǎng)物劃線接種到該平板上，置35培養(yǎng)16h18h。 由于該培養(yǎng)基抑制性強(qiáng)，其他非弧菌科細(xì)菌被抑制，而霍亂弧菌生長(zhǎng)迅速，16h菌落可達(dá)2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑濕潤(rùn)。培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，菌落略黃色、隆起，中心厚而不透明。質(zhì)量控制霍亂弧菌(小川、稻葉)生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)18h24h菌落直徑2.53.0mm；大腸埃希菌和變形桿菌抑制生長(zhǎng)。（由于臨床實(shí)驗(yàn)室不允許保存霍亂弧菌，實(shí)際工作中可用非01群弧菌代替）。保存 置4冰箱內(nèi)，1周內(nèi)用完。 注：1.該培養(yǎng)基國(guó)內(nèi)有商品出售，多數(shù)產(chǎn)品已加入慶大霉素，使用時(shí)，應(yīng)詳閱說(shuō)明書。2.“雙抗液”配制 98ml滅菌蒸餾水中加慶大霉素(25，000U/ml)1ml，多粘菌B或抗敵E(300，000U/ml)1ml。4冰箱保存一個(gè)月用完。 4.四號(hào)瓊脂(No.4 Agar) 用途 供分離霍亂弧菌用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 亞硫酸鈉(無(wú)水) 3g 檸檬酸鈉 10g 豬膽汁粉 5g 十二烷硫酸鈉 20g 利凡諾（雷佛奴爾） 3g 瓊脂粉 12g 慶大霉素亞碲酸鉀混合液 1ml 蒸餾水 1L pH 8.0 將上述8種成分放入玻璃或搪瓷容器內(nèi)(嚴(yán)禁用鋁制容器等金屬容器)，加入蒸餾水，加熱溶解混合后，調(diào)整至pH8.0,然后按1.2%加入瓊脂，煮沸至瓊脂溶化后，冷至60左右，按每100ml瓊脂加入慶大霉素亞碲酸鉀混合液(1ml 40，000U慶大霉素加79ml蒸餾水混合后，加入0.8g亞碲酸鉀溶解混合即成，每ml含500U的慶大霉素和10g/L亞碲酸鉀)0.1ml，搖勻，傾注平板。 取待檢標(biāo)本劃線接種平板，置35培養(yǎng)過(guò)夜。 8h后即可初步觀察結(jié)果，24h培養(yǎng)霍亂弧菌呈中心黑色較大而扁平的菌落，較易鑒別。質(zhì)量控制 配成的培養(yǎng)基呈亮黃色透明；EL-Tor弧菌稻葉型生長(zhǎng)良好；EL-Tor弧菌小川型生長(zhǎng)良好；大腸埃希菌ATCC25922抑制生長(zhǎng)。 注：1.慶大和亞碲酸鉀混合液應(yīng)新鮮配制并置冰箱保存。2.雷夫奴爾應(yīng)避光保存，而且每批均應(yīng)預(yù)試后方可使用。成品培養(yǎng)基應(yīng)避光保存。(二)腸桿菌分離培養(yǎng)基 1.中國(guó)藍(lán)瓊脂(Chinese blue Agar) 用途 系分離腸道菌的弱選擇性培養(yǎng)基。 配法 肉膏湯瓊脂(pH7.4) 1L 10g/L中國(guó)藍(lán)水溶液(滅菌) 10ml 乳糖 10g 10g/L薔薇紅酸乙醇溶液 10ml 取乳糖10g置于已滅菌的肉膏湯瓊脂瓶?jī)?nèi)，加熱溶解瓊脂并混勻。待冷卻至50左右，加入中國(guó)藍(lán)、薔薇 紅酸溶液混勻，立即傾注平板，凝固后備用。 將標(biāo)本接種平板，置3518h24h。分解乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌，其菌落呈藍(lán)色；不分解乳糖的細(xì)菌，菌落為淡紅色的透明菌落。 質(zhì)量控制大腸埃希菌ATCC 25922菌落呈藍(lán)色。痢疾志賀菌型ATCC 13313和鼠傷寒沙門菌ATCC 13311菌落呈淡紅色。保存 4冰箱保存，1周內(nèi)用完。 注：(1)中國(guó)藍(lán)水溶液需煮沸或高壓11515min滅菌后應(yīng)用。薔薇紅酸乙醇溶液無(wú)需滅菌，但加熱時(shí)應(yīng)避開火焰。 (2)薔薇紅酸能抑制革蘭陽(yáng)性細(xì)菌生長(zhǎng)，但對(duì)大腸埃希菌沒(méi)有抑制作用，標(biāo)本接種量不宜太多。(3)此培養(yǎng)基pH7.4，制好后應(yīng)呈淡紅色，若過(guò)堿呈鮮紅色，過(guò)酸則呈藍(lán)色，均不適用。 2.木糖、賴氨酸、去氧膽酸鹽(XLD)培養(yǎng)基 用途 為腸道菌選擇性培養(yǎng)基。 配法 酵母浸膏 3g L-賴氨酸 5g NaCl 5g D-木糖 3.75g 乳糖 7.5g 蔗糖 7.5g 去氧膽酸鈉 2.5g 硫代硫酸鈉 6.8g 枸櫞酸鐵銨 0.8g 瓊脂 13.5g 1%酚紅溶液 8ml 蒸餾水 1L 將上述成分(酚紅除外)混合，加熱溶解，校正pH至7.2,再加入酚紅溶液混勻。121高壓滅菌15min，傾注平板備用。 將標(biāo)本劃線接種平板，置35培養(yǎng)18h24h。大腸埃希菌、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬細(xì)菌在本培養(yǎng)基上形成黃色、不透明菌落；大多數(shù)沙門菌屬細(xì)菌因不利用糖類，為半透明紅色或無(wú)色菌落。質(zhì)量控制大腸埃希菌 呈黃色菌落；宋內(nèi)志賀菌 呈無(wú)色菌落；傷寒沙門菌 呈紅色菌落有黑心；金黃色葡萄球菌 抑制生長(zhǎng)保存 貯存于4有效期5天。 3.SS瓊脂(SalmonellaShigella agar) 用途 供沙門菌屬和志賀菌屬的分離培養(yǎng)用。 配法 月示胨 5g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 瓊脂 1520g 膽鹽(No.3) 3.5g 枸櫞酸鈉(2H2O) 8.5g 硫代硫酸鈉(5H2O) 8.5g 枸櫞酸鐵 1g 1%中性紅水溶液 2.5ml 0.1%煌綠水溶液 0.33ml 蒸餾水 1L pH 7.07.1 將上述成分(除中性紅，煌綠外)混合于水中，加熱煮沸溶解，校正pH，然后加入中性紅和煌綠水溶液，充分混勻冷卻至50時(shí)傾注平板。 將標(biāo)本接種平板，置35培養(yǎng)1824h。沙門菌屬其菌落呈無(wú)色半透明，產(chǎn)生H2S者菌落中心呈黑色。志賀菌屬的菌落呈無(wú)色半透明。大腸菌屬呈紅色渾濁。宋內(nèi)志賀菌能延緩發(fā)酵乳糖，培養(yǎng)24h后可以出現(xiàn)紅色菌落。腸道致病菌的菌落均可達(dá)1.5mm以上。 質(zhì)量控制大腸埃希菌菌落 呈紅色；痢疾志賀型、福氏志賀菌和傷寒沙門菌 生長(zhǎng)良好，菌落無(wú)色；腸炎或豬霍亂沙門菌菌落 呈黑色；糞腸球菌、金黃色葡萄球菌 不生長(zhǎng)。保存 避光，3天內(nèi)用完。注：煌綠要新配，中性紅要優(yōu)質(zhì)。 4.麥康凱瓊脂(Maconkey agar) 用途 供腸道致病菌的分離培養(yǎng)和非發(fā)酵細(xì)菌鑒別用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 膽鹽(豬、牛、羊) 5g 乳糖 10g 瓊脂 1520g 1%中性紅溶液 5ml 蒸水 1L pH 7.2 將上述成分(除中性紅外)稱量加入水中，加熱溶解，校正pH，加入中性紅溶液，分裝滅菌11520min，冷卻至50左右時(shí)傾注平板。 取標(biāo)本或增菌培養(yǎng)物接種平板，置35培養(yǎng)1824h。不發(fā)酵乳糖的腸道細(xì)菌呈無(wú)色菌落，直徑約2.0mm左右，光滑半透明。質(zhì)量控制大腸埃希菌菌落 呈桃紅色；痢疾志賀菌菌落 呈無(wú)色；傷寒沙門菌菌落 無(wú)色；金黃色葡萄球菌 不生長(zhǎng)。保存 置4冰箱(避光)，1周內(nèi)用完。注：非發(fā)酵細(xì)菌在該平板上是否生長(zhǎng)，是臨床鑒定某些非發(fā)酵細(xì)菌的指標(biāo)之一。 5.伊紅美藍(lán)瓊脂(Eosin methylene blue agar) 用途 供腸道致病菌及大腸菌群的分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氫二鉀 2g 20g/L伊紅Y水溶液 20ml 65g/L美藍(lán)水溶液 10ml 瓊脂 17g 蒸餾水 1L pH 7.1 將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂稱量混合于水中，并加熱煮沸溶解，校正pH，分裝滅菌12115min備用。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂加入乳糖，冷至5055時(shí)加入伊紅和美藍(lán)水溶液，搖勻傾注平板。 取糞便標(biāo)本或增菌培養(yǎng)物接種平板，置35培養(yǎng)18h24h。根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌?，挑取無(wú)色菌落或挑選紫紅色及有金屬光澤的菌落轉(zhuǎn)種克氏雙糖或三糖鐵瓊脂進(jìn)行鑒定。質(zhì)量控制 大腸埃希菌菌落 呈紫紅色，有時(shí)有金屬光澤，直徑2.3mm。傷寒沙門菌菌落呈灰白色，直徑1.8mm。金黃色葡萄球菌不生長(zhǎng)。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 6.克氏雙糖鐵瓊脂(Kliger iron agar) 用途 供腸桿菌科細(xì)菌的初步鑒定用。 配法 蛋白胨 20g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 50g 枸櫞酸鐵銨 0.5g 硫代硫酸鈉 0.5g 0.2%酚紅水溶液 5ml 瓊脂 12ml 蒸餾水 1L pH 7.5 將上述成分（除瓊脂、酚紅外）稱量混合于水中，加熱溶解，校正pH，再加入瓊脂和酚紅溶液，煮沸溶解分裝試管，每管4ml，經(jīng)115滅菌20min，立即制成高層斜面，待凝固后經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)備用。 取待檢菌純培養(yǎng)物，用接種針作底層穿刺和斜面劃線接種，置35培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。斜面變黃，底層變黃，產(chǎn)氣者或不產(chǎn)氣者多屬大腸埃希菌群及發(fā)酵乳糖的菌株。斜面變紅，底層變黃，為不發(fā)酵乳糖菌株。產(chǎn)H2S菌株可使底層或全管產(chǎn)生黑色反應(yīng)。質(zhì)量控制奇異變形桿菌 K/A H2S陽(yáng)性；大腸埃希菌 A/A；志賀痢疾桿菌 K/A；傷寒沙門菌 K/A H2S陽(yáng)性；銅綠假單胞菌 K/K。 保存 置4冰箱，2周內(nèi)用完。注:該培養(yǎng)基pH尤為重要，pH7.5時(shí)使用效果最佳。 7.三糖鐵瓊脂(Triple sugar iron agar) 用途 供腸桿菌科細(xì)菌初步生化鑒定用。 配法 蛋白胨 15g 月示胨 5g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 5g 硫酸亞鐵 0