河南省確山縣第二高級中學(xué)高中生物 專題5《2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》教學(xué)案 新人教版選修1.doc

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片段【教學(xué)目標(biāo)】1、通過嘗試pcr技術(shù)的基本操作，使學(xué)生體驗(yàn)pcr這一常規(guī)的分子生物學(xué)試驗(yàn)方法。2、理解pcr的原理，討論pcr的應(yīng)用?！局R梳理】 一、 基礎(chǔ)知識（一）pcr原理1、dna復(fù)制參與的組分在dna復(fù)制中的作用解旋酶打開dna雙鏈dna母鏈提供dna復(fù)制的模板_合成子鏈的原料dna聚合酶催化合成dna子鏈引物使dna聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸（1）條件：（2）3端和5端： dna的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ǔna的羥基末端稱為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端。（3）dna聚合酶只能從3端延伸dna ，因此，dna復(fù)制需要引物。dna的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸?！咀⒁狻恳锸莇na或rna，用于pcr的引物長度通常為2030個核苷酸。2、解旋：在dna的復(fù)制過程中，雙鏈的解開是dna復(fù)制的前提。在體外可通過控制溫度來實(shí)現(xiàn)。3、pcr（1）概念：pcr的全稱為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增dna片段的技術(shù)。（2）dna的熱變性原理：在80100的溫度范圍內(nèi)，dna的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性；當(dāng)溫度緩慢下降后，兩條被分離的dna鏈又會重新結(jié)合成雙鏈，這個過程稱為復(fù)性。（3）原理：dna的復(fù)制原理。（4）pcr反應(yīng)條件： 緩沖溶液。dna模板。分別與模板dna兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物。四種脫氧核苷酸。耐熱的dna聚合酶（一般用taq dna聚合酶）。能夠自動調(diào)控溫度的儀器：pcr儀。（5）pcr的反應(yīng)過程: pcr一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。變性：當(dāng)溫度上升到90以上時，雙鏈dna解聚為單鏈。復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈dna結(jié)合。延伸：當(dāng)溫度上升到72左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在dna聚合酶酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的dna鏈。（6）pcr的反應(yīng)結(jié)果：從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的dna單鏈會與引物結(jié)合，進(jìn)行dna的延伸，這樣，dna聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的dna序列，使這段固定長度的序列成2n擴(kuò)增。二、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（一）制備固定化酵母細(xì)胞1、酵母細(xì)胞的活化：由休眠狀態(tài)重新恢復(fù)為正常的生活狀態(tài)。2、配制物質(zhì)的量濃度為0.05mol/l的cacl2溶液。3、配制海藻酸鈉溶液：海藻酸鈉在水中溶解的速度較慢，需要通過加熱促使其溶解。加熱時最好采用小火間斷加熱的方法。如果加熱太快，海藻酸鈉會發(fā)生焦糊。4、海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合：將海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入已活化的海藻酸鈉溶液，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，使其混合均勻，攪拌后吸入到注射器中?、固定化酵母細(xì)胞：將注射器中的混合液滴加到cacl2溶液中，形成凝膠珠狀顆粒，在cacl2溶液中浸泡30min左右。（二）、用固定化酵母發(fā)酵1、將固定好的酵母細(xì)胞（凝膠珠）用蒸餾水沖洗23次。2、將10%葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入固定好的酵母細(xì)胞，置于25 下發(fā)酵24h。（三）結(jié)果分析與評價(jià)1、觀察凝膠珠的顏色和形狀如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉濃度濃度偏低，該種凝膠珠包埋的酵母細(xì)胞數(shù)目較少，影響實(shí)驗(yàn)效果；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。2、觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液：利用固定的酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時會聞到酒味。（四）、課題延伸：工業(yè)生產(chǎn)中，細(xì)胞的固定化技術(shù)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。（五）、歸納：1、加熱使海藻酸鈉溶化是操作中最重要的一步。海藻酸鈉的濃度涉及固定化細(xì)胞的質(zhì)量：如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少影響實(shí)驗(yàn)效果。2、觀察凝膠珠的顏色和形狀：如果制作的凝膠珠顏色過淺，呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗。三、操作提示1、為避免外源dna等因素的污染，pcr實(shí)驗(yàn)中使用的 微量離心管、槍頭、緩沖液 以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。2、pcr所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20儲存。3、在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊離心管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻。4、混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部?！镜湫屠}】1.pcr技術(shù)擴(kuò)增dna,需要的條件是(c)目的基因引物4種脫氧核苷酸dna聚合酶mrna核糖體a.b. c.d.2、引物的作用是（ d ） a打開dna雙鏈 b催化合成dna子鏈c提供模板 d使dna聚合酶能夠從引物的3端開始復(fù)制3、taqdna聚合酶的特點(diǎn)是（a ）a耐高溫 b耐鹽酸 c耐強(qiáng)堿 d不耐熱4、標(biāo)準(zhǔn)的pcr過程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是（ a ）a94 、55 、72 b72 、55 、92 c55、92 、72 d80 、55 、72 5、使用pcr儀的具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為( c )設(shè)計(jì)好pcr儀的循環(huán)程序按配方準(zhǔn)備好各組分用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分進(jìn)行pcr反應(yīng)離心使反應(yīng)液集中在離心管底部a.b. c.d.6、（ 2015年江蘇，23）下列關(guān)于實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果的分析，錯誤的是 （bd）a組織切片上滴加蘇丹染液，顯微觀察有橘黃色顆粒說明有脂肪b組織樣液中滴加斐林試劑，不產(chǎn)生磚紅色沉淀說明沒有還原糖c洋蔥表皮細(xì)胞滴加蔗糖溶液后，發(fā)生質(zhì)壁分離說明細(xì)胞有活