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成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞作者:滕勇,胡蘊(yùn)玉,安書(shū)杰,戴先文,趙黎,白建萍,李旭升,呂榮【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞【Abstract】AIM:Tobuildamethodtoculturebonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitroandtoinvestigatethefeasibilityofinducingMSCsintoosteoblasts.METHODS:HumanMSCswereisolatedfromadultbonemarrowandpurifiedbypercolldensitygradientcentrifugationandculturedinvitro.TheMSCsattachmentformedafter7-10dandtheMSCsofthepassage3werechosentoinduceintoosteoblasts.Fifteendayslater,thealkalinephosphataseassaywasconductedusingmodifiedcalciumcobaltstainingmethod,typecollagenandosteocalcinassaywasconductedusingimmunohistochemistryandcalciumnodeassaywasdoneusingalizarinredstaining.RESULTS:HomogeneousMSCswereobtainedbypercolldensitygradientcentrifugation.TheinducedMSCshadtypicalappearanceofosteoblasts.TherateofALPexpressionwas81%,theexpressionsofcollagentypeandosteocalcinwerepositive,andcalciumnodeswereseen.CONCLUSION:TheMSCscanbeseparatedfromadultbonemarrowandculturedinvitro,whichcanbeinducedintoosteoblasts.【Keywords】bonemarrow;stemcells;adult;tissueengineering;osteogenesis/drugeffects【摘要】目的:建立成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外培養(yǎng)的方法,并探討定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的途徑.方法:抽取成人骨髓,Percoll密度梯度離心法進(jìn)行體外培養(yǎng),貼壁細(xì)胞傳代,取第3代細(xì)胞在培養(yǎng)基中添加成骨誘導(dǎo)劑地塞米松、甘油磷酸、維生素C,培養(yǎng)15d后,在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),鈣鈷法染色檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)表達(dá),免疫組化(SABC法)檢測(cè)型膠原、骨鈣素表達(dá),茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)形成.結(jié)果:Percoll密度梯度離心法培養(yǎng)可獲得均一的MSCs;誘導(dǎo)分化的MSCs呈典型的成骨細(xì)胞形態(tài);ALP染色陽(yáng)性率可達(dá)81%以上;型膠原、骨鈣素表達(dá)陽(yáng)性;茜素紅染色見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)形成.結(jié)論:可以從成人骨髓中培養(yǎng)出MSCs,并可定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞,可用作臨床骨組織工程種子細(xì)胞.【關(guān)鍵詞】骨髓,干細(xì)胞;成年人;組織工程;骨生成/藥物作用0引言種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子是組織工程的三大要素,尋找合適的種子細(xì)胞是成功的重要因素1.目前骨組織工程種子細(xì)胞主要有骨、骨膜、骨髓和其他非骨組織.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)因其來(lái)源充足,取材方便安全,便于培養(yǎng)和基因修飾,增生活躍、多向分化及成骨能力確切2-4,從而受到廣泛關(guān)注,具有廣泛的應(yīng)用前景.自從Maniatopoulos等51988年首次報(bào)道鼠MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)可形成鈣化的骨樣組織以來(lái),從動(dòng)物骨髓誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞已不困難,人們目前已能從胎兒骨髓中分離出MSCs.成人骨髓中MSCs含量較少,能否分離、分離的方法如何是目前研究的方向.本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上建立臨床成人MSCs的培養(yǎng)和誘導(dǎo)成骨的方法,為組織工程走向臨床作準(zhǔn)備.1材料和方法1.1材料骨髓取自5例骨科取髂骨患者,年齡分別為28,30,35,55,60歲.2例診斷脊柱滑脫;3例診斷四肢骨不連接.5例均無(wú)代謝性骨病及結(jié)核,肝腎功能正常.經(jīng)知情同意,術(shù)中取髂骨前從髂后上棘抽取骨髓5mL,吸入加有0.5mL肝素的20mL無(wú)菌注射器.主要試劑:LDMEM低糖培養(yǎng)基、胰酶均為Gibco產(chǎn)品,胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品,地塞米松、甘油磷酸、維生素C均為Sigma產(chǎn)品,Percoll分離液Pharmacia產(chǎn)品.兔抗人型膠原多克隆抗體及免疫組化(SABC法)檢測(cè)試劑盒為中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,鼠抗人骨鈣素mAb為體美國(guó)BD公司產(chǎn)品,50mL一次性塑料培養(yǎng)瓶為美國(guó)Coster公司產(chǎn)品,噻唑藍(lán)(MTT)為華美生物工程公司產(chǎn)品.完全培養(yǎng)基組成:LDMEM加入10mL/L胎牛血清,青、鏈霉素終濃度1667kat/L.成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基:完全培養(yǎng)基加地塞米松、甘油磷酸、維生素C,終濃度分別為110-8mol/L,50mg/L,10mmol/L.1.2方法1.2.1成人MSCs原代培養(yǎng)MSCs的分離將抽取的骨髓加入裝有5mL磷酸鹽緩沖液(PBS)的離心管,吸管吹打混勻,800r/min離心10min,棄去上層7mL脂滴及上清,剩余上清與細(xì)胞混勻,沿管壁緩慢滴加底部裝有Percoll(體積質(zhì)量1.073kg/L)分離液的離心管中,900g離心30min,吸取界面云霧狀白膜層,加入PBS,800r/min離心10min洗滌2遍,計(jì)數(shù).2例55歲以上患者來(lái)源骨髓以4107接種于50mL培養(yǎng)瓶,另外3例以2107接種于50mL培養(yǎng)瓶.5d后半量換液,第710日見(jiàn)有較多貼壁細(xì)胞后全量換液,此后23d換液1次,細(xì)胞90%匯合時(shí)2.5g/L胰酶消化13傳代.1.2.2成人MSCs向成骨細(xì)胞表型誘導(dǎo)取生長(zhǎng)良好的第2代細(xì)胞,更換培養(yǎng)液為成骨條件培養(yǎng)液,培養(yǎng)14d,以2108/L接種于孔底預(yù)先鋪好1cm2經(jīng)過(guò)酸處理過(guò)的細(xì)胞玻璃爬片的24板,36h細(xì)胞完全貼壁后,取出玻片做以下處理:40g/L多聚甲醛固定20min,型膠原和骨鈣素免疫組化染色(SABC法),型膠原DAB顯色,骨鈣素?zé)晒怙@色.950mL/L乙醇固定15min,堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)鈣鈷法染色,觀察陽(yáng)性細(xì)胞百分比:隨機(jī)抽取5張爬片,每張隨機(jī)觀察200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算ALP染色陽(yáng)性者并計(jì)算平均值和百分比.擬作鈣結(jié)節(jié)染色的爬片,2109/L接種,24h貼壁后繼續(xù)條件培養(yǎng)液培養(yǎng),1wk左右細(xì)胞密集,有結(jié)節(jié)形成,40g/L多聚甲醛固定20min,飽和茜素紅溶液染色.1.2.3誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)曲線、貼壁率的影響將生長(zhǎng)良好的第2代細(xì)胞傳代后,對(duì)照組用完全培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組用條件培養(yǎng)液培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底消化后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):調(diào)整細(xì)胞密度為2107/L,接種9塊90孔培養(yǎng)板,2組/板,6孔/組,150L/孔.繼續(xù)完全培養(yǎng)液和條件培養(yǎng)液培養(yǎng).參照文獻(xiàn)6,每24h取出一板,用MTT比色實(shí)驗(yàn)測(cè)生長(zhǎng)曲線.以時(shí)間為橫坐標(biāo),6孔吸光度的平均值為縱坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)曲線.取底面積12cm2的培養(yǎng)瓶,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各12個(gè),接種細(xì)胞4105/瓶.每2h取出1瓶,倒去培養(yǎng)液,胰酶消化,計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞,計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的貼壁率(貼壁率已貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)100%).以時(shí)間為橫坐標(biāo),貼壁率為縱坐標(biāo),繪制曲線.2結(jié)果2.1倒置顯微鏡觀察剛接種的細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液,并混有少量血細(xì)胞.5d后半量換液,骨髓中的外周血及造血干細(xì)胞等非貼壁細(xì)胞被除去,可見(jiàn)大量單核細(xì)胞,圓形、未完全貼壁;710d可見(jiàn)單核細(xì)胞貼壁,變成梭形或多角形;10d后逐漸增多并連接成片,形成多個(gè)成纖維樣細(xì)胞集落;1418d細(xì)胞逐漸匯集,胰酶消化傳代后細(xì)胞漩渦狀生長(zhǎng),排列整齊,多呈長(zhǎng)梭形或多角形,較薄、有突起,突起的數(shù)目及形態(tài)各不相同(Fig1).細(xì)胞在完全培養(yǎng)液下,13傳代可以連續(xù)傳代10代.5代以前生長(zhǎng)迅速,平均5d傳代1次;6代以后增殖緩慢,78d傳代1次;至第9代,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,10d長(zhǎng)滿瓶底,細(xì)胞伸展不良,胞體增大,胞質(zhì)稀薄,折光性減弱,同時(shí)伴細(xì)胞崩解、死亡.2例取自55歲以上患者骨髓培養(yǎng)的MSCs,貼壁時(shí)間比另外3例晚23d,貼壁細(xì)胞數(shù)量較少,需要加大原代培養(yǎng)的細(xì)胞初始接種密度.首次傳代時(shí)間約為2023d,傳4代以后細(xì)胞增殖緩慢.2.2ALP鈣鈷法染色在使用條件培養(yǎng)液的細(xì)胞中,大部分成陽(yáng)性反應(yīng),大多角形細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性,而梭形細(xì)胞染色略弱,采用網(wǎng)格法計(jì)數(shù),陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的81%(Fig2).2.3型膠原和骨鈣素免疫組織化學(xué)檢測(cè)經(jīng)SABC法染色經(jīng)過(guò)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)15d的MSCs胞質(zhì)分泌型膠原和骨鈣素,染色陽(yáng)性.而未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組為陰性(Fig3,4).2.4茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色MSCs經(jīng)誘導(dǎo),可形成鈣結(jié)節(jié),細(xì)胞密集部出現(xiàn)致密的、圓形紅染(Fig5).2.5生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)Fig6.根據(jù)公式TD=tlg2(lgNtlgN0)-1得出成人MSCs倍增時(shí)間37h,成骨誘導(dǎo)后倍增時(shí)間41h.2.6貼壁率MSCs24h貼壁率可達(dá)82%(Fig7).3討論MSCs的培養(yǎng)方法有全骨髓法和密度梯度離心法7.全骨髓培養(yǎng)法是將抽取的骨髓不經(jīng)任何處理加入培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),其中的外周血細(xì)胞和造血干細(xì)胞等可隨著換液逐漸被清除;離心法利用骨髓中各種細(xì)胞的密度不同,通過(guò)密度梯度離心吸取單核細(xì)胞層進(jìn)行培養(yǎng),獲得的細(xì)胞均一、純度高,且視野清晰,便于早期觀察.全骨髓法培養(yǎng)單核細(xì)胞增殖快、貼壁早,約早于離心法23d.推測(cè)可能是全骨髓法保存了骨髓環(huán)境中的豐富的黏附分子和各種生長(zhǎng)因子,而離心法可能去除了這些因子,并且分離液和長(zhǎng)時(shí)間的常溫操作對(duì)細(xì)胞有損傷.本實(shí)驗(yàn)是為后期MSCs的永生化打基礎(chǔ),希望獲得高純度的MSCs,因此我們采用了密度梯度離心法.MSCs為條件成骨細(xì)胞,許多學(xué)者研究表明地塞米松、甘油磷酸、維生素C是MSCs向成骨分化的必要條件8.地塞米松在促進(jìn)細(xì)胞向成骨分化的同時(shí)提高AP的活性,調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原合成8,9.維生素C促進(jìn)MSCs合成膠原,形成鈣化,并能調(diào)節(jié)ATP、AP活性和非膠原基質(zhì)蛋白的合成8.甘油磷酸在培養(yǎng)液中迅速被AP水解,產(chǎn)生大量磷酸離子,促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積和鈣化,是MSCs誘導(dǎo)發(fā)生礦化結(jié)節(jié)的必要條件8.此外,低糖DMEM有利于MSCs的存活,降低細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)采用加入地塞米松、甘油磷酸、維生素C的DMEM低糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)特征和生物學(xué)特征.我們的實(shí)驗(yàn)以成人骨髓為培養(yǎng)材料建立起成人MSCs的培養(yǎng)方法和成骨誘導(dǎo)途徑,為組織工程的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ).我們?cè)隗w外分離培養(yǎng)的成人MSCs細(xì)胞,形態(tài)良好、增生活躍,并且可以誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞,據(jù)本實(shí)驗(yàn)觀察1mL40歲以下成人骨髓經(jīng)3代培養(yǎng)后,貼壁細(xì)胞數(shù)可以達(dá)到51061107數(shù)量級(jí),55歲以上則數(shù)量減少,但仍可培養(yǎng)誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞.顯示在成人,甚至老年人同樣可以獲取骨髓MSCs10.研究還發(fā)現(xiàn),人MSCs經(jīng)誘導(dǎo)生成的礦化結(jié)節(jié)是連續(xù)的,而鼠MSCs在同樣條件下生成的礦化結(jié)節(jié)不連續(xù),與未礦化細(xì)胞群分隔,這與Bellows等的研究結(jié)果一致11.顯示種屬間差異在MSCs培養(yǎng)中不容忽視,對(duì)人的MSCs研究是組織工程進(jìn)入臨床必須的12-14.【參考文獻(xiàn)】1JenkinsDD,YangGP,LorenzHP,etal.TissueengineeringandregenerativemedicineJ.ClinPlastSurg,2003;30(4):581-588.2KuoCK,TuanRS.TissueengineeringwithmesenchymalstemcellsJ.IEEEEngMedBiolMag,2003;22(5):51-56.3CongetPA,MinguellJJ.PhenotypicalandfunctionalpropertiesofhumanbonemarrowmesenchymalprogenitorcellsJ.JCellPhysiol,1999;181(1):67-73.4JaiswalRK,JaiswalN,BruderSP.AdulthumanmesenchymalstemcelldifferentiationtotheosteogenicoradipogeniclineageisregulatedbymitogenactivatedproteinkinaseJ.JBiolChem,2000;275(13):9645-9652.5ManiatopoulosC,SodekJ,MelcherAH.BoneformationinvitrobystromalcellsobtainedfrombonemarrowofyoungadultratsJ.CellTissueRes,1988;254(2):317-330.6司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)M.西安:世界圖書(shū)出版社,1996:186-187.7江遜,崔鵬程,陳文玄,等.定向誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的初步研究J.中華耳鼻咽喉科雜志,2002;37(2):137-139.JiangX,CuiPC,ChenWX,etal.StudyonthedirectedinducingprocessofcartilagecellsdifferentiatedfromhumanmarrowmesenchymalstemcellsJ.ChinJOtorhinolaryngol,2002;37(2):137-139.8CoelhoMJ,FernandesMH.Humanbonecellculturesinbiocompatibilitytesting.Part:Effectofascorbicacid,betaglycerophosphateanddexamethasoneonosteoblasticdifferentiationJ.Biomaterials,2000;21(11):1095-1102.9BellowsCG,HeerscheJN,AubinJE.Determinationofthecapacityforproliferationanddifferent

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