成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞.doc

成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞作者：滕勇，胡蘊(yùn)玉，安書杰，戴先文，趙黎，白建萍，李旭升，呂榮【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞【Abstract】AIM:Tobuildamethodtoculturebonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitroandtoinvestigatethefeasibilityofinducingMSCsintoosteoblasts.METHODS:HumanMSCswereisolatedfromadultbonemarrowandpurifiedbypercolldensitygradientcentrifugationandculturedinvitro.TheMSCsattachmentformedafter7-10dandtheMSCsofthepassage3werechosentoinduceintoosteoblasts.Fifteendayslater,thealkalinephosphataseassaywasconductedusingmodifiedcalciumcobaltstainingmethod,typecollagenandosteocalcinassaywasconductedusingimmunohistochemistryandcalciumnodeassaywasdoneusingalizarinredstaining.RESULTS:HomogeneousMSCswereobtainedbypercolldensitygradientcentrifugation.TheinducedMSCshadtypicalappearanceofosteoblasts.TherateofALPexpressionwas81%,theexpressionsofcollagentypeandosteocalcinwerepositive,andcalciumnodeswereseen.CONCLUSION:TheMSCscanbeseparatedfromadultbonemarrowandculturedinvitro,whichcanbeinducedintoosteoblasts.【Keywords】bonemarrow；stemcells；adult；tissueengineering；osteogenesis/drugeffects【摘要】目的：建立成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外培養(yǎng)的方法，并探討定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的途徑.方法：抽取成人骨髓，Percoll密度梯度離心法進(jìn)行體外培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞在培養(yǎng)基中添加成骨誘導(dǎo)劑地塞米松、甘油磷酸、維生素C，培養(yǎng)15d后，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，鈣鈷法染色檢測堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)，免疫組化（SABC法）檢測型膠原、骨鈣素表達(dá)，茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)形成.結(jié)果：Percoll密度梯度離心法培養(yǎng)可獲得均一的MSCs；誘導(dǎo)分化的MSCs呈典型的成骨細(xì)胞形態(tài)；ALP染色陽性率可達(dá)81%以上；型膠原、骨鈣素表達(dá)陽性；茜素紅染色見鈣結(jié)節(jié)形成.結(jié)論：可以從成人骨髓中培養(yǎng)出MSCs，并可定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，可用作臨床骨組織工程種子細(xì)胞.【關(guān)鍵詞】骨髓，干細(xì)胞；成年人；組織工程；骨生成/藥物作用0引言種子細(xì)胞、支架材料、生長因子是組織工程的三大要素，尋找合適的種子細(xì)胞是成功的重要因素1.目前骨組織工程種子細(xì)胞主要有骨、骨膜、骨髓和其他非骨組織.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（marrowmesenchymalstemcells,MSCs）因其來源充足，取材方便安全，便于培養(yǎng)和基因修飾，增生活躍、多向分化及成骨能力確切2-4，從而受到廣泛關(guān)注，具有廣泛的應(yīng)用前景.自從Maniatopoulos等51988年首次報道鼠MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)可形成鈣化的骨樣組織以來，從動物骨髓誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞已不困難，人們目前已能從胎兒骨髓中分離出MSCs.成人骨髓中MSCs含量較少，能否分離、分離的方法如何是目前研究的方向.本研究在動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上建立臨床成人MSCs的培養(yǎng)和誘導(dǎo)成骨的方法，為組織工程走向臨床作準(zhǔn)備.1材料和方法1.1材料骨髓取自5例骨科取髂骨患者，年齡分別為28,30,35，55,60歲.2例診斷脊柱滑脫；3例診斷四肢骨不連接.5例均無代謝性骨病及結(jié)核，肝腎功能正常.經(jīng)知情同意，術(shù)中取髂骨前從髂后上棘抽取骨髓5mL，吸入加有0.5mL肝素的20mL無菌注射器.主要試劑:LDMEM低糖培養(yǎng)基、胰酶均為Gibco產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品，地塞米松、甘油磷酸、維生素C均為Sigma產(chǎn)品，Percoll分離液Pharmacia產(chǎn)品.兔抗人型膠原多克隆抗體及免疫組化（SABC法）檢測試劑盒為中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人骨鈣素mAb為體美國BD公司產(chǎn)品，50mL一次性塑料培養(yǎng)瓶為美國Coster公司產(chǎn)品，噻唑藍(lán)（MTT）為華美生物工程公司產(chǎn)品.完全培養(yǎng)基組成：LDMEM加入10mL/L胎牛血清，青、鏈霉素終濃度1667kat/L.成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基加地塞米松、甘油磷酸、維生素C，終濃度分別為110-8mol/L,50mg/L,10mmol/L.1.2方法1.2.1成人MSCs原代培養(yǎng)MSCs的分離將抽取的骨髓加入裝有5mL磷酸鹽緩沖液（PBS）的離心管，吸管吹打混勻，800r/min離心10min，棄去上層7mL脂滴及上清，剩余上清與細(xì)胞混勻，沿管壁緩慢滴加底部裝有Percoll（體積質(zhì)量1.073kg/L）分離液的離心管中，900g離心30min，吸取界面云霧狀白膜層，加入PBS，800r/min離心10min洗滌2遍，計(jì)數(shù).2例55歲以上患者來源骨髓以4107接種于50mL培養(yǎng)瓶，另外3例以2107接種于50mL培養(yǎng)瓶.5d后半量換液，第710日見有較多貼壁細(xì)胞后全量換液，此后23d換液1次，細(xì)胞90%匯合時2.5g/L胰酶消化13傳代.1.2.2成人MSCs向成骨細(xì)胞表型誘導(dǎo)取生長良好的第2代細(xì)胞，更換培養(yǎng)液為成骨條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)14d，以2108/L接種于孔底預(yù)先鋪好1cm2經(jīng)過酸處理過的細(xì)胞玻璃爬片的24板，36h細(xì)胞完全貼壁后，取出玻片做以下處理：40g/L多聚甲醛固定20min，型膠原和骨鈣素免疫組化染色（SABC法），型膠原DAB顯色，骨鈣素?zé)晒怙@色.950mL/L乙醇固定15min，堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）鈣鈷法染色，觀察陽性細(xì)胞百分比：隨機(jī)抽取5張爬片，每張隨機(jī)觀察200個細(xì)胞，計(jì)算ALP染色陽性者并計(jì)算平均值和百分比.擬作鈣結(jié)節(jié)染色的爬片，2109/L接種，24h貼壁后繼續(xù)條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，1wk左右細(xì)胞密集，有結(jié)節(jié)形成，40g/L多聚甲醛固定20min，飽和茜素紅溶液染色.1.2.3誘導(dǎo)培養(yǎng)對生長曲線、貼壁率的影響將生長良好的第2代細(xì)胞傳代后，對照組用完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞長滿瓶底消化后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：調(diào)整細(xì)胞密度為2107/L，接種9塊90孔培養(yǎng)板，2組/板，6孔/組，150L/孔.繼續(xù)完全培養(yǎng)液和條件培養(yǎng)液培養(yǎng).參照文獻(xiàn)6，每24h取出一板，用MTT比色實(shí)驗(yàn)測生長曲線.以時間為橫坐標(biāo)，6孔吸光度的平均值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線.取底面積12cm2的培養(yǎng)瓶，實(shí)驗(yàn)組與對照組各12個，接種細(xì)胞4105/瓶.每2h取出1瓶，倒去培養(yǎng)液，胰酶消化，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，計(jì)算每個時間點(diǎn)的貼壁率（貼壁率已貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)100%）.以時間為橫坐標(biāo)，貼壁率為縱坐標(biāo)，繪制曲線.2結(jié)果2.1倒置顯微鏡觀察剛接種的細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液，并混有少量血細(xì)胞.5d后半量換液，骨髓中的外周血及造血干細(xì)胞等非貼壁細(xì)胞被除去，可見大量單核細(xì)胞，圓形、未完全貼壁；710d可見單核細(xì)胞貼壁，變成梭形或多角形；10d后逐漸增多并連接成片，形成多個成纖維樣細(xì)胞集落；1418d細(xì)胞逐漸匯集，胰酶消化傳代后細(xì)胞漩渦狀生長，排列整齊，多呈長梭形或多角形，較薄、有突起，突起的數(shù)目及形態(tài)各不相同（Fig1）.細(xì)胞在完全培養(yǎng)液下，13傳代可以連續(xù)傳代10代.5代以前生長迅速，平均5d傳代1次；6代以后增殖緩慢，78d傳代1次；至第9代，細(xì)胞生長緩慢，10d長滿瓶底，細(xì)胞伸展不良，胞體增大，胞質(zhì)稀薄，折光性減弱，同時伴細(xì)胞崩解、死亡.2例取自55歲以上患者骨髓培養(yǎng)的MSCs，貼壁時間比另外3例晚23d，貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，需要加大原代培養(yǎng)的細(xì)胞初始接種密度.首次傳代時間約為2023d，傳4代以后細(xì)胞增殖緩慢.2.2ALP鈣鈷法染色在使用條件培養(yǎng)液的細(xì)胞中，大部分成陽性反應(yīng)，大多角形細(xì)胞呈強(qiáng)陽性，而梭形細(xì)胞染色略弱，采用網(wǎng)格法計(jì)數(shù)，陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的81%（Fig2）.2.3型膠原和骨鈣素免疫組織化學(xué)檢測經(jīng)SABC法染色經(jīng)過條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)15d的MSCs胞質(zhì)分泌型膠原和骨鈣素，染色陽性.而未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組為陰性（Fig3,4）.2.4茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色MSCs經(jīng)誘導(dǎo)，可形成鈣結(jié)節(jié)，細(xì)胞密集部出現(xiàn)致密的、圓形紅染（Fig5）.2.5生長曲線細(xì)胞生長曲線見Fig6.根據(jù)公式TD=tlg2（lgNtlgN0）-1得出成人MSCs倍增時間37h，成骨誘導(dǎo)后倍增時間41h.2.6貼壁率MSCs24h貼壁率可達(dá)82%（Fig7）.3討論MSCs的培養(yǎng)方法有全骨髓法和密度梯度離心法7.全骨髓培養(yǎng)法是將抽取的骨髓不經(jīng)任何處理加入培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，其中的外周血細(xì)胞和造血干細(xì)胞等可隨著換液逐漸被清除；離心法利用骨髓中各種細(xì)胞的密度不同，通過密度梯度離心吸取單核細(xì)胞層進(jìn)行培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞均一、純度高，且視野清晰，便于早期觀察.全骨髓法培養(yǎng)單核細(xì)胞增殖快、貼壁早，約早于離心法23d.推測可能是全骨髓法保存了骨髓環(huán)境中的豐富的黏附分子和各種生長因子，而離心法可能去除了這些因子，并且分離液和長時間的常溫操作對細(xì)胞有損傷.本實(shí)驗(yàn)是為后期MSCs的永生化打基礎(chǔ)，希望獲得高純度的MSCs，因此我們采用了密度梯度離心法.MSCs為條件成骨細(xì)胞，許多學(xué)者研究表明地塞米松、甘油磷酸、維生素C是MSCs向成骨分化的必要條件8.地塞米松在促進(jìn)細(xì)胞向成骨分化的同時提高AP的活性，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長因子，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原合成8，9.維生素C促進(jìn)MSCs合成膠原，形成鈣化，并能調(diào)節(jié)ATP、AP活性和非膠原基質(zhì)蛋白的合成8.甘油磷酸在培養(yǎng)液中迅速被AP水解，產(chǎn)生大量磷酸離子，促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積和鈣化，是MSCs誘導(dǎo)發(fā)生礦化結(jié)節(jié)的必要條件8.此外，低糖DMEM有利于MSCs的存活，降低細(xì)胞對凋亡的敏感性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)采用加入地塞米松、甘油磷酸、維生素C的DMEM低糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)特征和生物學(xué)特征.我們的實(shí)驗(yàn)以成人骨髓為培養(yǎng)材料建立起成人MSCs的培養(yǎng)方法和成骨誘導(dǎo)途徑，為組織工程的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ).我們在體外分離培養(yǎng)的成人MSCs細(xì)胞，形態(tài)良好、增生活躍，并且可以誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，據(jù)本實(shí)驗(yàn)觀察1mL40歲以下成人骨髓經(jīng)3代培養(yǎng)后，貼壁細(xì)胞數(shù)可以達(dá)到51061107數(shù)量級，55歲以上則數(shù)量減少，但仍可培養(yǎng)誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞.顯示在成人，甚至老年人同樣可以獲取骨髓MSCs10.研究還發(fā)現(xiàn)，人MSCs經(jīng)誘導(dǎo)生成的礦化結(jié)節(jié)是連續(xù)的，而鼠MSCs在同樣條件下生成的礦化結(jié)節(jié)不連續(xù)，與未礦化細(xì)胞群分隔，這與Bellows等的研究結(jié)果一致11.顯示種屬間差異在MSCs培養(yǎng)中不容忽視，對人的MSCs研究是組織工程進(jìn)入臨床必須的12-14.【參考文獻(xiàn)】1JenkinsDD,YangGP,LorenzHP,etal.TissueengineeringandregenerativemedicineJ.ClinPlastSurg,2003；30(4):581-588.2KuoCK,TuanRS.TissueengineeringwithmesenchymalstemcellsJ.IEEEEngMedBiolMag,2003；22(5):51-56.3CongetPA,MinguellJJ.PhenotypicalandfunctionalpropertiesofhumanbonemarrowmesenchymalprogenitorcellsJ.JCellPhysiol,1999；181(1):67-73.4JaiswalRK,JaiswalN,BruderSP.AdulthumanmesenchymalstemcelldifferentiationtotheosteogenicoradipogeniclineageisregulatedbymitogenactivatedproteinkinaseJ.JBiolChem,2000；275(13):9645-9652.5ManiatopoulosC,SodekJ,MelcherAH.BoneformationinvitrobystromalcellsobtainedfrombonemarrowofyoungadultratsJ.CellTissueRes,1988；254(2):317-330.6司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)M.西安：世界圖書出版社,1996:186-187.7江遜，崔鵬程，陳文玄，等.定向誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的初步研究J.中華耳鼻咽喉科雜志，2002；37(2):137-139.JiangX,CuiPC,ChenWX,etal.StudyonthedirectedinducingprocessofcartilagecellsdifferentiatedfromhumanmarrowmesenchymalstemcellsJ.ChinJOtorhinolaryngol,2002；37(2):137-139.8CoelhoMJ,FernandesMH.Humanbonecellculturesinbiocompatibilitytesting.Part:Effectofascorbicacid,betaglycerophosphateanddexamethasoneonosteoblasticdifferentiationJ.Biomaterials,2000；21(11):1095-1102.9BellowsCG,HeerscheJN,AubinJE.Determinationofthecapacityforproliferationanddifferent