Cdh1小干擾RNA載體的構(gòu)建及鑒定.doc

Cdh1小干擾RNA載體的構(gòu)建及鑒定【摘要】目的：構(gòu)建Cdh1小干擾RNA載體，并將其轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞進(jìn)行鑒定.方法：根據(jù)pENTRTM/H1/TO中間載體要求，設(shè)計(jì)Cdh1小干擾RNA載體的干擾序列及無干擾作用的對照序列，合成相應(yīng)的DNA單鏈，退火后連接到pENTRTM/H1/TO線性載體，形成完整載體，進(jìn)行測序鑒定.分別將測序鑒定成功的Cdh1小干擾RNA載體及對照載體采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h提取細(xì)胞總RNA及細(xì)胞總蛋白，采用實(shí)時(shí)定量PCR和WesternBlot檢測Cdh1的表達(dá).結(jié)果：經(jīng)測序鑒定成功構(gòu)建Cdh1小干擾RNA載體和對照載體，分別命名為pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol.與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染pENTR/shcontrol的Hela細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pENTR/shCdh1的Hela細(xì)胞Cdh1表達(dá)降低（P<；0.05）.結(jié)論：成功構(gòu)建Cdh1小干擾RNA載體，并能下調(diào)Hela細(xì)胞Cdh1的表達(dá).【關(guān)鍵詞】細(xì)胞周期細(xì)胞分裂RNA小干擾Hela細(xì)胞0引言Cdh1是細(xì)胞周期后期分裂促進(jìn)復(fù)合物（anaphasepromotingcomplex，APC）的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用.近年來研究發(fā)現(xiàn)，Cdh1APC在哺乳動物神經(jīng)元中有大量表達(dá)，具有調(diào)節(jié)軸突生長和突觸形成的功能，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用1.為了進(jìn)一步探討Cdh1的功能，我們擬構(gòu)建Cdh1小干擾RNA載體，并將其轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞進(jìn)行鑒定.1材料和方法1.1材料pENTRTM/H1/TO載體試劑盒、TOP10感受態(tài)細(xì)菌和脂質(zhì)體Lipofectamine2000均購自Invitrogen公司（美國）；DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清購自Gibco公司（美國）；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自Takara公司（日本）；LightCycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Roche公司（美國）.1.2方法1.2.1載體的構(gòu)建根據(jù)pENTRTM/H1/TO載體要求和參考文獻(xiàn)2設(shè)計(jì)Cdh1小干擾RNA載體的干擾序列及無干擾作用的對照序列，合成相應(yīng)的DNA單鏈，具體設(shè)計(jì)如下:干擾序列topstrand5CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGAGACTTCTCA3,bottomstrand5AAAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGACTTCTCATT3；對照序列topstrand5CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC3,bottomstrand5AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT3.將干擾序列和對照序列根據(jù)退火條件95退火4min，室溫自然冷卻510min得到退火產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接到pENTRTM/H1/TO線性載體上，16連接2h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌，平鋪入含卡那霉素（50mg/L）抗性平板中過夜培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng).提取質(zhì)粒后，由英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序鑒定.質(zhì)粒分別命名為pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol.1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1d將Hela細(xì)胞傳代至六孔板，密度為90左右，在2個(gè)Eppendorf管中均加入250LOPTIMEM培養(yǎng)基，然后分別加入10L脂質(zhì)體和4g質(zhì)?；靹颍覝叵路跤?min.輕柔混合兩管液體，37孵育20min，加入Hela細(xì)胞中，將細(xì)胞置于37,50mL/LCO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4h后換成含有100mL/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基.轉(zhuǎn)染后48h，提取細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測Cdh1的表達(dá)以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以actin基因?yàn)閮?nèi)參照，94變性5s，60退火及延伸20s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，分析融解曲線.Cdh1基因上游引物為5GCCAACTGGAGCGTGAACTT3，下游引物為5TTCAGCAGTGCGGAGTAGGC3.actin基因上游引物為5TGACAGGATGCAGAAGGAGA3，下游引物為5TAGAGCCACCAATCCACACA3.以Ct表示Cdh1的表達(dá)，Ct=Ct（Cdh1）-Ct（actin），Ct值越高，Cdh1的表達(dá)越低WesternBlot檢測Cdh1的表達(dá)分別提取轉(zhuǎn)pENTR/shcdh1,pENTR/shcontrol及未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞總蛋白，以actin為內(nèi)參照，取等量的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,用50g/L脫脂奶粉封閉1h，加10mg/L抗Cdh1mAb或抗actinmAb，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，漂洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色23min，水洗后照相.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以xs表示，采用方差分析，P<；0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1載體的構(gòu)建經(jīng)測序公司鑒定后構(gòu)建的質(zhì)粒pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol，序列完全正確，無堿基突變.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測Hela細(xì)胞Cdh1的表達(dá)融解曲線分析表明設(shè)計(jì)的引物均得到了特異性的產(chǎn)物，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染pENTR/shcontrol的Hela細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pENTR/shCdh1的Hela細(xì)胞Cdh1表達(dá)明顯降低（P<；0.05,表1）.表1實(shí)時(shí)定量PCR檢測Hela細(xì)胞中Cdh1的表達(dá)（略）2.3WesternBlot檢測Cdh1蛋白的表達(dá)與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染pENTR/shcontrol的Hela細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pENTR/shCdh1的Hela細(xì)胞Cdh1蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖1).3討論細(xì)胞周期分裂后期促進(jìn)復(fù)合物及其調(diào)節(jié)亞基Cdh1不僅在增殖細(xì)胞中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)其在哺乳動物大腦皮質(zhì)、海馬、小腦等部位的終分化神經(jīng)元核內(nèi)有大量的表達(dá)，且具有泛素化周期蛋白B的活性，泛素化其他的底物，發(fā)揮其潛在作用4.研究表明在不同類型的神經(jīng)元，Cdh1APC的表達(dá)降低引起的結(jié)果可能也不一樣.在胚胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，降低Cdh1APC的表達(dá)，周期蛋白B表達(dá)升高，使細(xì)胞異常地重新進(jìn)入細(xì)胞周期，引起神經(jīng)元的凋亡5；而在新生鼠小腦顆粒神經(jīng)元，抑制Cdh1APC的表達(dá)及活性，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元仍可存活，且軸突增長1.RNA干擾技術(shù)是指生物體內(nèi)導(dǎo)入短的雙鏈RNA(dsRNA)后使體內(nèi)同源基因特異性的沉默.siRNA的來源有多種，如化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄合成及利用質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)siRNA.2002年，Brummelkamp等6首次使用小鼠H1啟動子構(gòu)建了小發(fā)卡RNA（smallhairpinRNA，shRNA）表達(dá)載體pSUPER，并證實(shí)轉(zhuǎn)染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動物細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá).在體內(nèi)表達(dá)的shRNA與dsRNA很接近，它包含了兩個(gè)由一個(gè)小環(huán)序列分離的短反向重復(fù)序列，是由Pol啟動子控制的.此方法可以長期抑制目的基因表達(dá)，因此,本課題選擇載體構(gòu)建的方法來實(shí)現(xiàn)基因下調(diào).實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化、比較不同組織的mRNA表達(dá)差異等.本研究我們通過脂質(zhì)體法將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pENTR/shCdh1的Hela細(xì)胞Cdh1表達(dá)明顯降低，說明該載體具有基因下調(diào)作用.【參考文獻(xiàn)】1KonishiY,StegmullerJ,MatsudaT,etal.Cdh1APCcontrolsaxonalgrowthandpatterninginthemammalianbrainJ.Science,2004,303（5660）:1026-1030.2BashirT,DorrelloNV,AmadorV,etal.ControloftheSCF(Skp2Cks1)ubiquitinligasebytheAPC/C(Cdh1)ubiquitinligaseJ.Nature,2004,428（6979）:190-193.3LivakKJ,SchmittgenTD.AnalysisofrelativegeneexpressiondatausingrealtimequantitativePCRandthe2(DeltaDeltaC(T)methodJ.Methods,2001,25(4):402-408.4GieffersC,PetersBH,KramerER,etal.ExpressionoftheCDH1associatedformoftheanaphasepromotingcomplexinpostmitoticneuronsJ.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96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