手足口病中醫(yī)證型與血清炎性細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞相關(guān)性分析.doc

手足口病中醫(yī)證型與血清炎性細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞相關(guān)性分析 摘要：目的研究手足口?。℉FMD）肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證與白細(xì)胞介素-6（IL-6）、降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）及CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞之間的相關(guān)性。方法隨機(jī)選取90例HFMD患者，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證各30例，檢測(cè)血清炎性細(xì)胞因子（IL-6、PCT、CRP）、T細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）、NK細(xì)胞等指標(biāo)，分析上述指標(biāo)在各證型間的分布情況。結(jié)果毒熱動(dòng)風(fēng)證IL-6、PCT、CRP水平明顯高于肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞絕對(duì)值毒熱動(dòng)風(fēng)證與肺脾濕熱證組、濕熱郁蒸證組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；CD3+細(xì)胞百分比毒熱動(dòng)風(fēng)證組與肺脾濕熱證組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），與濕熱郁蒸證組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；CD4+細(xì)胞百分比毒熱動(dòng)風(fēng)證組與肺脾濕熱證組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），與濕熱郁蒸證組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；CD8+、NK細(xì)胞百分比毒熱動(dòng)風(fēng)證組與肺脾濕熱證組、濕熱郁蒸證組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。結(jié)論HFMD肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證在相關(guān)炎性細(xì)胞因子、促炎標(biāo)志物及T細(xì)胞亞群等方面不僅與發(fā)病有關(guān)，并且與病情輕重及預(yù)后密切相關(guān)，能夠較為有效地評(píng)估病情及判斷預(yù)后。關(guān)鍵詞：手足口??；白細(xì)胞介素-6；降鈣素原；C反應(yīng)蛋白；T細(xì)胞亞群DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.xx.07.005：R259.125：A：1005-5304（xx）07-0017-05AnalysisonCorrelationBetweenTCMSyndromesofHand，F(xiàn)ootandMouthDiseaseandSerumProinflammatoryCytokines，TCellSubgroupandNKCellsHUANGWei，LIQin（FuzhouInfectiousDiseaseHospital，F(xiàn)uzhou350000，China）Abstract：ObjectiveTostudythecorrelationbetweenhand，footandmouthdisease（HFMD）inlung-spleendamp-heatsyndrome，syndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat，andsyndromeofstirringwindduetotoxic-heatwithIL-6，PCT，CRP，CD3+，CD4+，CD8+andNKcells.MethodsNiypatientswithHFMDwererandomlyselected，dividingintolung-spleendamp-heatsyndrome，syndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat，andsyndromeofstirringwindduetotoxic-heat，30casesforeachsyndrome.IL-6，PCT，CRP，CD3+，CD4+，CD8+andNKcellsweredetected，andthedistributionofaboveindicatorsinthethreesyndromeswereanalyzed.ResultsLevelsofIL-6，PCTandCRPinsyndromeofstirringwindduetotoxic-heatweresignificantlyhigherthanthoseinlung-spleendamp-heatsyndromeandsyndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat，withstatisticalsignificance（P0.01）；TherewasstatisticalsignificanceinabsolutevaluecountingofCD3+，CD4+，CD8+andNKcellsamongthethreesyndromes（P0.01）；TherewasstatisticalsignificanceinthepercentageofCD3+cellsinsyndromeofstirringwindduetotoxic-heatandlung-spleendamp-heatsyndrome（P0.01）andsyndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat（P0.05）；TherewasstatisticalsignificanceinthepercentageofCD4+cells基金項(xiàng)目：國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治（xxZX10004301-005）；福州市衛(wèi)生系統(tǒng)科技計(jì)劃項(xiàng)目（xx-S-wt8）通訊作者：李芹，E-mail：liqing0591xx163.syndromeofstirringwindduetotoxic-heatandlung-spleendamp-heatsyndrome（P0.05）andsyndromeofstagnationandsteamingduetodamp-heat（P0.01）；TherewasstatisticalsignificanceinthepercentagesofCD8+andNKcellsinthethreesyndromes（P0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。1.2納入標(biāo)準(zhǔn)年齡最小6個(gè)月，最大6歲；病程在48h內(nèi)；符合手足口病診療指南（xx年版）4中肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證中醫(yī)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。肺脾濕熱證主癥：發(fā)熱，手、足和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，口腔黏膜出現(xiàn)散在皰疹，咽紅、流涎，神情倦怠，舌淡紅或紅，苔膩，脈數(shù)，指紋紅紫。濕熱郁蒸證主癥：高熱，疹色不澤，口腔潰瘍，精神萎頓，舌紅或絳、少津，苔黃膩，脈細(xì)數(shù)，指紋紫黯。毒熱動(dòng)風(fēng)證主癥：高熱不退，易驚，嘔吐，肌肉瞤動(dòng)，或見(jiàn)肢體痿軟，甚則昏矇，舌黯紅或紅絳，苔黃膩或黃燥，脈弦細(xì)數(shù)，指紋紫滯；患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。1.3排除標(biāo)準(zhǔn)HFMD核酸檢測(cè)未檢出相關(guān)病毒者；合并其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、發(fā)育不健全者；合并其他病毒感染如巨細(xì)胞、EB病毒感染及HIV、水痘、麻疹者。1.4觀察指標(biāo)與方法1.4.1血清細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞患者均于就診當(dāng)日抽取靜脈血3mL，3000r/min離心10min（美國(guó)BeckmanGS-15R離心機(jī)），留取血清，無(wú)菌分裝后置于-80冰箱備用（T細(xì)胞亞群檢測(cè)均于抽血后常溫保存并在4h內(nèi)檢測(cè)）。IL-6、PCT檢測(cè)均應(yīng)用羅氏電化學(xué)發(fā)光法診斷試劑，采用羅氏E601全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)；CRP檢測(cè)使用BodiTechi-CHROMA試劑盒及配套艾可美分析儀。CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞采用美國(guó)BectonDickinson流式細(xì)胞儀及配套試劑檢測(cè)。均按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。1.4.2腸道病毒核酸分型患者均于就診當(dāng)日采集肛拭子標(biāo)本，用中山大學(xué)達(dá)安公司生產(chǎn)的診斷試劑盒，美國(guó)生命科學(xué)公司Steponeplus-RealTimePCR儀定量分析。取約2g糞便于離心管中，加入10mL磷酸鹽緩沖液、2g玻璃珠、1mL氯仿，振蕩混勻，3500r/min離心20min，取上清液140?L，提取RNA。反應(yīng)體系為25?L：熒光RT-PCR反應(yīng)液20?L，DNA聚合酶1?L，反轉(zhuǎn)錄酶0.35?L，模板RNA5?L，充分混勻，6000r/min離心10s。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增程序：50反轉(zhuǎn)錄30min；95預(yù)變性3min；95變性15s，50退火30s，72延伸30min，共5個(gè)循環(huán)；95變性10s，55退火40s，采集熒光，共40個(gè)循環(huán)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用xs表示，組間比較采用2檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1中醫(yī)證型與血清促炎因子的相關(guān)性毒熱動(dòng)風(fēng)證IL-6明顯高于另兩證（P=0.003）；毒熱動(dòng)風(fēng)證PCT明顯高于另兩證（P=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CRP也明顯高于另兩證（P肺脾濕熱證=0.002，P濕熱郁蒸證=0.037）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證IL-6、PCT、CRP比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。2.2中醫(yī)證型與T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的相關(guān)性毒熱動(dòng)風(fēng)證CD3+計(jì)數(shù)與肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，P=0.006）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD4+計(jì)數(shù)與另兩證比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD8+計(jì)數(shù)與另兩證比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，P=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證NK細(xì)胞計(jì)數(shù)與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表3。2.3中醫(yī)證型與T細(xì)胞亞群百分比的相關(guān)性毒熱動(dòng)風(fēng)證CD3+百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.012，P濕熱郁蒸證=0.041）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD4+百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.033，P濕熱郁蒸證=0.001）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD8+百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.008，P濕熱郁蒸證=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證NK細(xì)胞百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.000，P濕熱郁蒸證=0.000）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞百分比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表4。2.4中醫(yī)證型與核酸病毒分型的相關(guān)性分析經(jīng)核酸病毒分型檢測(cè)，肺脾濕熱證中CoxA16型19例、EV71型8例、其他通用型3例；濕熱郁蒸證中CoxA16型21例、EV71型4例、其他通用型5例；毒熱動(dòng)風(fēng)證中CoxA16型21例、EV71型4例、其他通用型5例。可見(jiàn)，毒熱動(dòng)風(fēng)證中EV71型病毒感染明顯高于另兩證，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證均以感染CoxA16為主，而毒熱動(dòng)風(fēng)證以感染EV71型病毒為主，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=52.74，P=0.002），結(jié)果見(jiàn)表5。3討論中醫(yī)無(wú)HFMD相關(guān)病名，現(xiàn)代中醫(yī)家多將其歸為“溫病”范疇。該病多由學(xué)齡期小兒感染，該時(shí)期小兒臟氣未充，正氣不足，病邪易于乘虛而入，損傷正氣，主要證素為濕和熱，感染疫毒癘氣之邪后導(dǎo)致氣機(jī)逆亂和氣虛，表現(xiàn)為發(fā)熱、精神差等，熱毒夾濕從皮膚口鼻而入，濕熱郁于肌表，則見(jiàn)手足丘皰疹；內(nèi)傳心脾，心脾積熱，濕熱郁蒸，阻滯氣機(jī)，表現(xiàn)為咳嗽、嘔吐、納差、腹痛。火熱之邪易傷津動(dòng)風(fēng)耗氣，擾動(dòng)肝風(fēng)，出現(xiàn)肢體抖動(dòng)、煩躁、驚跳等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀5。素問(wèn)評(píng)熱病論篇有“邪之所湊，其氣必虛”，加之為小兒稚陰稚陽(yáng)之體，素體內(nèi)熱偏勝，脾胃積熱，脾常不足，且多嗜食肥膩甘甜之品，易脾胃積熱，脾失健運(yùn)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，外加感受邪毒，內(nèi)應(yīng)于脾而發(fā)病，濕熱相搏6，正氣抗邪外出，毒隨氣泄，外透肌膚，則見(jiàn)皰疹，甚者濕熱內(nèi)浸，波及氣營(yíng)，則出現(xiàn)氣營(yíng)兩燔證，表現(xiàn)為高熱不退、皰疹密集等癥。臨床根據(jù)HFMD辨證分型為肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證2個(gè)普通證型及毒熱動(dòng)風(fēng)證1個(gè)重癥證型，3種證型在IL-6、PCT、CRP、CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞等方面均存在差異。IL-6是機(jī)體內(nèi)的促炎因子，在HFMD發(fā)病過(guò)程中與機(jī)體免疫防疫、炎性損傷等病理生理過(guò)程有關(guān)7，HFMD由腸道病毒感染引起，導(dǎo)致一系列免疫調(diào)節(jié)損傷及炎癥反應(yīng)，而促炎細(xì)胞因子在該過(guò)程中發(fā)揮著重要作用8。本研究中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的IL-6水平明顯低于毒熱動(dòng)風(fēng)證，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明毒熱動(dòng)風(fēng)證較另2個(gè)較輕證型IL-6水平表達(dá)異常，提示IL-6可能與HFMD病情密切相關(guān)。PCT是降鈣素的前體，正常情況時(shí)主要在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞內(nèi)合成，一般在嚴(yán)重感染及創(chuàng)傷等情況下明顯升高，同樣也參與炎癥反應(yīng)，在臨床中多用于監(jiān)測(cè)感染輕重程度9。PCT具有早期、特異、敏感的特性，優(yōu)于傳統(tǒng)的炎性標(biāo)志物，且對(duì)病情的早期評(píng)估、預(yù)后評(píng)價(jià)、療效觀察等具有一定意義10。3組患兒中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的PCT水平明顯低于毒熱動(dòng)風(fēng)證，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明毒熱動(dòng)風(fēng)證較其他2個(gè)較輕證型的PCT水平表達(dá)異常，提示PCT的表達(dá)可能與HFMD病情密切相關(guān)，在一定程度上能反映疾病的嚴(yán)重程度。CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，主要由IL-6刺激肝臟和上皮細(xì)胞合成和分泌，也是炎癥反應(yīng)的非特異性指標(biāo)，在HFMD早期診斷中有一定價(jià)值11。本研究中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的CRP水平明顯低于毒熱動(dòng)風(fēng)證，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明CRP的高低對(duì)疾病的嚴(yán)重程度評(píng)估有一定意義。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)細(xì)胞，也是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能起到調(diào)節(jié)機(jī)體正常免疫功能的作用，正常情況下CD3+、CD4+、CD8+計(jì)數(shù)及百分比均維持動(dòng)態(tài)平衡，以維持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定12。在本研究中，毒熱動(dòng)風(fēng)證CD3+、CD4+、CD8+計(jì)數(shù)及百分比均低于肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證，HFMD時(shí)感染腸道病毒，導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)制失調(diào)，T淋巴細(xì)胞亞群分布異常13，B淋巴細(xì)胞表達(dá)和分泌的血清免疫球蛋白受T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)，當(dāng)CD4+細(xì)胞減少或功能低下時(shí)，其產(chǎn)生淋巴因子協(xié)助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力也相對(duì)減弱14。機(jī)體免疫力下降既是HFMD感染的前提，也是病情加重、影響預(yù)后的重要因素。毒熱動(dòng)風(fēng)證屬重證HFMD，相較于其他2個(gè)普通證型，細(xì)胞免疫功能明顯低下，在疾病發(fā)展過(guò)程中檢測(cè)T細(xì)胞亞群水平，既能綜合評(píng)估病情，又能評(píng)估預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。NK細(xì)胞是人體內(nèi)固有免疫中的一種重要的效應(yīng)細(xì)胞，它可以繞過(guò)T細(xì)胞受體（TCR）/CD3識(shí)別途徑，以主要組織相容性復(fù)合物（MHC）非限制方式迅速識(shí)別和殺滅入侵的病原菌，同時(shí)分泌大量干擾素-等細(xì)胞因子，上調(diào)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，在抗感染、抗腫瘤等方面發(fā)揮突出的作用，NK細(xì)胞的升高能在HFMD轉(zhuǎn)歸及預(yù)后方面有積極作用1