昆蟲桿狀病毒載體.ppt

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng),高遄 生物化學與分子生物 2120422,前言,高表達 低成本 安全性高 大規(guī)模生產,前言,昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前國內外十分推崇的真核表達系統(tǒng)。利用桿狀病毒結構基因中多角體蛋白的強啟動子構建的表達載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達。 具有高效表達、基因克隆容量大、重組病毒易于篩選、安全性高、且有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)等特點，現已成為基因工程四大表達系統(tǒng)之一。 利用該表達系統(tǒng)獲得重組蛋白可用于藥物開發(fā)、疫苗生產、生物殺蟲劑等多個領域。據文獻統(tǒng)計，已有1000 余種外源基因在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中得到了成功地表達，其中約有95% 的外源重組蛋白能夠被正確的轉譯后加工修飾，具有與天然蛋白相同的生物活性。,昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng),2.桿狀病毒載體表達系統(tǒng)的特點,3.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的應用,1.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的構成,4. 參考文獻,1.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的構成,1.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的構成,表達過程 將外源目的基因插入到啟動子下游 與桿狀病毒重組，獲得重組病毒 將重組的病毒純化 感染昆蟲細胞或蟲體 外源基因隨著病毒的復制而獲得表達,1.1 桿狀病毒載體,1.1.1桿狀病毒簡介 桿狀病毒是研究細胞分子生物學的重要工具，同時也是外源基因在昆蟲細胞中表達的載體。桿狀病毒只來源于無脊椎動物，已發(fā)現600多種桿狀病毒，其中僅有不到20 種進行了分子生物學研究。 桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA 分子， 大小為80 160kb，其基因組可在昆蟲細胞核復制和轉錄。DNA 復制后組裝在桿狀病毒的核衣內，后者具有較大的柔韌性，可容納較大片段的外源DNA 插入，因此是表達大片段DNA 的理想載體。其中, 用作外源基因表達載體的桿狀病毒，目前僅限于核型多角體病毒( nuclear poly hedrosis virus, NPV) 。,1.1 桿狀病毒載體,現已知基因組全序列的桿狀病毒僅有7 種: 苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒( AcMNPV ) 家蠶核多角體病毒( BmNPV ) 黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒( LdMNPV ) 甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒( SeMNPV) 棉鈴蟲核型多角體病毒( HaNPV) 斜紋夜蛾核型多角體病毒( SpltMNPV),1.1 桿狀病毒載體,AcMNPV 是昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中最常用的載體，基因表達分為4 個階段: 立即早期基因表達、早期基因表達、晚期基因表達和極晚期基因表達。 早于DNA 復制 病毒DNA 合成 多角體蛋白是形成包含體的主要成分，感染后期在細胞中的積累可高達30% 50%，是病毒復制非必需成分，但對病毒粒子卻有保護作用，可使之保持穩(wěn)定和感染能力。 P10 蛋白為另一類高效表達的極晚期蛋白，也是一類病毒復制非必需成分，可在細胞中形成纖維狀物質，可能與細胞溶解有關。,理想的外源基因插入位點,1.1 桿狀病毒載體,載體重組原理：原理是人為將桿狀病毒多角體蛋白兩翼序列的同源序列引入含外源基因的質粒載體中，通過同源重組方式來實現外源基因對病毒多角體蛋白基因的替換。 由于桿狀病毒分子質量約為134kb，不能利用多克隆位點（酶切連接）進行基因重組，只能利用桿狀病毒和帶有外源基因的質粒載體進行共轉染（轉移載體的介導）。,多克隆位點：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內切酶識別位點。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。 共轉染：物理上不相連的基因被整合到同一整合序列并在同一轉染細胞內表達的現象。,1.1 桿狀病毒載體,1.1.2桿狀病毒載體的重組 將極晚期基因( 如多角體基因及其邊界區(qū)) 克隆入細菌的質粒中 消除其編碼區(qū)和不合適的酶切位點 保留其5c端對高效表達必需的調控區(qū) 在下游引入合適的酶切位點供外源基因的插入，即得到轉移載體。 將要表達的外源基因插入其啟動子下游 與野生型AcNPV DNA 共轉染昆蟲細胞 通過兩側同源邊界區(qū)在體內發(fā)生同源重組，使多角體蛋白基因被外源基因取代。,1.1 桿狀病毒載體,1.1.3桿狀病毒載體的篩選 由于多角體基因被破壞，則不能形成多角體。這種表型在進行常規(guī)空斑測定時，可同野生型具有多角體的病毒空斑區(qū)別開來， 這就是最初的篩選重組病毒的方式。 由于重組效率較低( 0. 1% 1%) ，表型差別不顯著，應用上有一定的困難。,1.1 桿狀病毒載體,1.1.3桿狀病毒載體的篩選 為此，經過不斷探索，在重組桿狀病毒的篩選與鑒定方面取得了很大改進。 具體方法有以下幾種： -半乳糖苷酶的藍白篩選 體外酶促定位重組 Bacmid TK 基因 Neo 基因,Bacmid,Luckow 等開發(fā)。快速、高效產生重組AcMNPV 病毒。取桿狀病毒( baculovirus) 和質粒( plasmid) 的英文字頭字尾命名為Bacmid，即桿狀病毒質粒之意。 根據F因子載體原理，用類似于酵母體內重組的方法，構建了一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid。該載體可像質粒一樣在大腸桿菌中生長，又對鱗翅目昆蟲細胞具有感染性。 Bacmid 含有F因子復制子( 可在大腸桿菌中復制) 、卡那霉素抗性基因及Tn7 轉座位點attTn7。 轉移載體中，外源基因置于桿狀病毒啟動子之下, 兩端分別為Tn7的左右端。以其轉化含Bacmid的E.coli菌株，由輔助質粒提供反式作用發(fā)生轉座，而將外源基因轉到Bacmid的attTn7位置。,Bacmid,在Bacmid 中，外源基因被核多角體啟動子控制，并包含了多種抗性基因及LacZ 缺失標記，極大地方便了重組病毒的篩選及鑒定。這種重組了外源基因的Bacmid轉染的昆蟲細胞，可得到100%陽性重組病毒 。 操作簡單方便，只需1 周即可完成重組病毒載體的構建。,Bacmid,由于我國有養(yǎng)蠶業(yè)，還可在AcMNPV Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的基礎上進行改造，構建能夠應用于家蠶的BmNPV Bac-to-Bac 表達系統(tǒng)，這將大大減少傳統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源重組蛋白所需時間，極大地提高了工作效率。還能夠解決培養(yǎng)昆蟲細胞成本高，難于規(guī)?；a等問題。 重組率100%、操作簡便、1 周完成重組、全部操作都在細菌中進行，取名為Bac-to-Bac 表達系統(tǒng),1.2 昆蟲細胞宿主,昆蟲細胞在生物學、醫(yī)學、農業(yè)等領域中被作為非常重要的研究工具。 目前全世界建立的昆蟲細胞系有800 多株，分別來源于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目、同翅目和半翅目8 個目的170 余種昆蟲，其中具有實際應用的細胞系大部分來自鱗翅目和雙翅目。 以昆蟲桿狀病毒為載體的昆蟲細胞可成功、高效地表達外源基因，生產具有重要藥用價值和具備天然活性的重組蛋白。因此，在眾多昆蟲細胞系中鱗翅目昆蟲細胞系應用最為廣泛。,1.2 昆蟲細胞宿主,昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)既可在昆蟲培養(yǎng)細胞中，又可在昆蟲和蛹內進行表達。究竟在昆蟲體內還是在培養(yǎng)細胞中表達外源基因，可根據外源蛋白的性質及其用途、表達水平高低、分離純化難易、純化要求高低等因素來考慮。 然而，對于常規(guī)小量及高純度的蛋白質生產而言，利用體外培養(yǎng)的昆蟲細胞來進行表達是首選途徑。 相對于已知的上百萬種昆蟲以及昆蟲細胞系的廣泛用途來說，已經建立的細胞系還遠遠不夠，仍需建立更多的昆蟲細胞系以滿足實際需要。,Company Logo,2.桿狀病毒載體表達系統(tǒng)的特點,安全性高,基因容量大,表達水平高,能進行翻譯后的加工修飾,重組蛋白具有完整的生物學功能,2.桿狀病毒載體表達系統(tǒng)的特點,相對其他表達系統(tǒng)它具有以下幾個方面的特點： 重組蛋白具有完整的生物學功能：桿狀病毒表達系統(tǒng)可為高表達的外源蛋白在細胞內進行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達產物在結構及功能上接近天然蛋白。 利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)來表達富含二硫鍵的一些具有神經毒性的生物毒素肽將是一個最佳的選擇。,2.桿狀病毒載體表達系統(tǒng)的特點,能進行翻譯后的加工修飾：桿狀病毒表達系統(tǒng)具有對蛋白質完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、?；?、信號肽切除及肽段的切割和分解等，修飾的位點與天然蛋白在細胞內的情況完全一致。 對比實驗證明，在昆蟲細胞發(fā)生的糖基化位點與哺乳動物細胞中完全一致，但修飾的寡糖種類卻不完全一樣。這種不一致對不同目的蛋白的活性影響不同，所以昆蟲表達系統(tǒng)還可作為一個研究糖基化對蛋白質結構與功能影響方面的理想模型。,2.桿狀病毒載體表達系統(tǒng)的特點,表達水平高：與其它真核表達系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特點就是能獲得重組蛋白高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50。 雖然目前科研工作者大都是在細胞培養(yǎng)條件下進行表達外源基因，當條件成熟時需要大量制備某類外源蛋白時，最好采用昆蟲幼蟲或蛹。因為培養(yǎng)昆蟲幼蟲和蛹遠比培養(yǎng)細胞簡單、廉價，而且利用昆蟲幼蟲或蛹能夠顯著提高外源基因的表達水平。 利用BmNPV 載體在家蠶幼蟲中成功表達出重組蜘蛛牽引絲蛋白，表達量高達每個昆蟲活體6mg。一般在幼蟲體內的淋巴液中，蛋白質表達量較在細胞培養(yǎng)基中高10倍以上。因此，通過昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)可利用昆蟲活體大規(guī)模生產各種重組蛋白。,2.桿狀病毒載體表達系統(tǒng)的特點,基因容量大：昆蟲桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為80 200kb，其基因組可在昆蟲細胞核中復制和轉錄。DNA 復制后組裝在桿狀病毒的毒粒內，由于毒粒具有較大的柔韌性，能包裝較大的基因片段，可表達非常大( 100kb) 的外源性基因。因此是表達大片段DNA 的理想載體。但目前尚無實驗得知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。 我們感興趣的另外一個特點是在昆蟲桿狀病毒載體內還可多基因同時表達，具有在同一個感染昆蟲細胞內同時表達多個外源基因的能力。根據設計需要既可采用不同的重組桿狀病毒同時感染細胞的形式，也可在同一桿狀病毒載體上同時克隆多個外源基因，其表達產物之間可有蛋白質的相互作用或加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。,2.桿狀病毒載體表達系統(tǒng)的特點,安全性高：由于桿狀病毒的天然宿主是昆蟲，不能在哺乳動物細胞內復制病毒DNA 以及增殖病毒，桿狀病毒不會感染人。因此對細胞的生理影響較哺乳類病毒載體要小，同時實驗操作者的自身安全也比較有保障。 現有研究也表明其啟動子在哺乳動物細胞中沒有活性，因此在表達癌基因或有潛在毒性的蛋白質時可能優(yōu)于其他表達系統(tǒng)。最新研究發(fā)現，AcMNPV 病毒作為哺乳動物細胞基因轉移載體，也可以將外源基因導入哺乳動物的細胞，如人的肝細胞。這意味AcMNPV 病毒可能成為哺乳動物基因治療的媒介體，因此桿狀病毒有望在未來人類的基因治療中得到應用。,3.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的應用,昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)廣泛應用于藥物研發(fā)、疫苗生產、重組病毒殺蟲劑等眾多領域中。其中，在生物分子研究中，具有代表性的是重組蛋白的表達，是目前桿狀病毒表達系統(tǒng)應用最多的領域。成功表達出具有藥用價值的蛋白質又可用于藥物研發(fā)和疫苗生產。,3.1 基礎研究,功能基因組學（functional genomics）的重要內容是研究基因組內各種蛋白質的結構和功能，蛋白質之間以及蛋白質和核酸之間的相互關系。 實現這一計劃的前提是要生產幾萬種蛋白質 ，這就要求蛋白質表達系統(tǒng)提供新的技術，諸如：通過簡單的操作，生產各種活性形式的蛋白質簡化操作過程，縮短從基因生產蛋白質的時間以簡便的操作，同時生產許多種蛋白質。 最新的研究和技術發(fā)展業(yè)已表明，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是解決上述問題的優(yōu)良系統(tǒng)，以昆蟲蟲體為宿主是十分有魅力的。 日本片倉公司在這方面進行了卓有成效的探索導入Invitrogen公司的GATEWAY系統(tǒng) ，利用Bac-to-Bac系統(tǒng)的載體，通過單一的LR Clonase就能同時構建各種帶目的基因的BEVS質粒轉移載體；用缺失增殖所必須的線型化病毒DNA、含缺失增殖所必需基因的質粒轉移載體和外源基因同時感染蠶蛹，通過此法，不用篩選就能在短期內獲得正確的重組病毒和目的蛋白，由于使用的是蠶蛹，這種技術還可以自動化操作。,3.2開發(fā)醫(yī)用疫苗和藥物,由BEVS生產的疫苗研究早已開始，HIV疫苗于20世紀80年代 ,瘧疾疫苗于90年代進人臨床 ,但由于這2種疾病的特殊性，所有其他來源的疫苗都缺乏良好保護性，所以未能被使用。 盡管如此，臨床試驗亦證明了昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)來源的重組蛋白對人是安全的。由家蠶宿主昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)重組多膚藥物國內外尚無產品，其主要障礙在于這是一個新的宿主系統(tǒng)，且發(fā)達國家無養(yǎng)蠶業(yè)。國內口服重組昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)多膚藥物已有開發(fā)，正進人藥物審批階段，相信昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)重組多膚生產醫(yī)用藥物會有較好的前景。,3.3 產業(yè)化,在眾多應用中，重組病毒殺蟲劑作為一類重要的具有開發(fā)潛力的生物殺蟲劑，將是未來最容易產業(yè)化的一條成功之路。 昆蟲桿狀病毒具有宿主專一、致病力強、傳播快、無殘留、無抗藥性、對脊椎動物和植物安全、不易引起廣泛規(guī)模的生態(tài)平衡的破壞等特點。昆蟲桿狀病毒作為生物殺蟲劑第一次進入市場在20 世紀70 年代，當時是直接使用野生型病毒。實踐表明，生物殺蟲劑與化學殺蟲劑相比，具有殺蟲速度慢、殺蟲譜窄、成本高等缺點。故使病毒殺蟲劑的商品化生產和推廣應用受到了很大限制。為此，科研人員通過基因工程方法改造桿狀病毒，不僅可以克服野生型病毒的固有缺點，而且為擴大病毒殺蟲功能提供了潛在可能。,參考文獻,朱幫福,盧茲凡.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的研究進展.細胞與分子免疫學雜志,2002,18(6):681-683. 高炳淼,李寶珠,于津鵬,胡遠艷,長孫東亭,羅素蘭. 外源基因在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達.