昆蟲桿狀病毒載體.ppt

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),高遄 生物化學(xué)與分子生物 2120422,前言,高表達(dá) 低成本 安全性高 大規(guī)模生產(chǎn),前言,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動子構(gòu)建的表達(dá)載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。 具有高效表達(dá)、基因克隆容量大、重組病毒易于篩選、安全性高、且有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一。 利用該表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白可用于藥物開發(fā)、疫苗生產(chǎn)、生物殺蟲劑等多個(gè)領(lǐng)域。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，已有1000 余種外源基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功地表達(dá)，其中約有95% 的外源重組蛋白能夠被正確的轉(zhuǎn)譯后加工修飾，具有與天然蛋白相同的生物活性。,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),3.昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用,1.昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成,4. 參考文獻(xiàn),1.昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成,1.昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成,表達(dá)過程 將外源目的基因插入到啟動子下游 與桿狀病毒重組，獲得重組病毒 將重組的病毒純化 感染昆蟲細(xì)胞或蟲體 外源基因隨著病毒的復(fù)制而獲得表達(dá),1.1 桿狀病毒載體,1.1.1桿狀病毒簡介 桿狀病毒是研究細(xì)胞分子生物學(xué)的重要工具，同時(shí)也是外源基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載體。桿狀病毒只來源于無脊椎動物，已發(fā)現(xiàn)600多種桿狀病毒，其中僅有不到20 種進(jìn)行了分子生物學(xué)研究。 桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA 分子， 大小為80 160kb，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。DNA 復(fù)制后組裝在桿狀病毒的核衣內(nèi)，后者具有較大的柔韌性，可容納較大片段的外源DNA 插入，因此是表達(dá)大片段DNA 的理想載體。其中, 用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限于核型多角體病毒( nuclear poly hedrosis virus, NPV) 。,1.1 桿狀病毒載體,現(xiàn)已知基因組全序列的桿狀病毒僅有7 種: 苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒( AcMNPV ) 家蠶核多角體病毒( BmNPV ) 黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒( LdMNPV ) 甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒( SeMNPV) 棉鈴蟲核型多角體病毒( HaNPV) 斜紋夜蛾核型多角體病毒( SpltMNPV),1.1 桿狀病毒載體,AcMNPV 是昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中最常用的載體，基因表達(dá)分為4 個(gè)階段: 立即早期基因表達(dá)、早期基因表達(dá)、晚期基因表達(dá)和極晚期基因表達(dá)。 早于DNA 復(fù)制 病毒DNA 合成 多角體蛋白是形成包含體的主要成分，感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá)30% 50%，是病毒復(fù)制非必需成分，但對病毒粒子卻有保護(hù)作用，可使之保持穩(wěn)定和感染能力。 P10 蛋白為另一類高效表達(dá)的極晚期蛋白，也是一類病毒復(fù)制非必需成分，可在細(xì)胞中形成纖維狀物質(zhì)，可能與細(xì)胞溶解有關(guān)。,理想的外源基因插入位點(diǎn),1.1 桿狀病毒載體,載體重組原理：原理是人為將桿狀病毒多角體蛋白兩翼序列的同源序列引入含外源基因的質(zhì)粒載體中，通過同源重組方式來實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)Σ《径嘟求w蛋白基因的替換。 由于桿狀病毒分子質(zhì)量約為134kb，不能利用多克隆位點(diǎn)（酶切連接）進(jìn)行基因重組，只能利用桿狀病毒和帶有外源基因的質(zhì)粒載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)移載體的介導(dǎo)）。,多克隆位點(diǎn)：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。 共轉(zhuǎn)染：物理上不相連的基因被整合到同一整合序列并在同一轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的現(xiàn)象。,1.1 桿狀病毒載體,1.1.2桿狀病毒載體的重組 將極晚期基因( 如多角體基因及其邊界區(qū)) 克隆入細(xì)菌的質(zhì)粒中 消除其編碼區(qū)和不合適的酶切位點(diǎn) 保留其5c端對高效表達(dá)必需的調(diào)控區(qū) 在下游引入合適的酶切位點(diǎn)供外源基因的插入，即得到轉(zhuǎn)移載體。 將要表達(dá)的外源基因插入其啟動子下游 與野生型AcNPV DNA 共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 通過兩側(cè)同源邊界區(qū)在體內(nèi)發(fā)生同源重組，使多角體蛋白基因被外源基因取代。,1.1 桿狀病毒載體,1.1.3桿狀病毒載體的篩選 由于多角體基因被破壞，則不能形成多角體。這種表型在進(jìn)行常規(guī)空斑測定時(shí)，可同野生型具有多角體的病毒空斑區(qū)別開來， 這就是最初的篩選重組病毒的方式。 由于重組效率較低( 0. 1% 1%) ，表型差別不顯著，應(yīng)用上有一定的困難。,1.1 桿狀病毒載體,1.1.3桿狀病毒載體的篩選 為此，經(jīng)過不斷探索，在重組桿狀病毒的篩選與鑒定方面取得了很大改進(jìn)。 具體方法有以下幾種： -半乳糖苷酶的藍(lán)白篩選 體外酶促定位重組 Bacmid TK 基因 Neo 基因,Bacmid,Luckow 等開發(fā)?？焖佟⒏咝Мa(chǎn)生重組AcMNPV 病毒。取桿狀病毒( baculovirus) 和質(zhì)粒( plasmid) 的英文字頭字尾命名為Bacmid，即桿狀病毒質(zhì)粒之意。 根據(jù)F因子載體原理，用類似于酵母體內(nèi)重組的方法，構(gòu)建了一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid。該載體可像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中生長，又對鱗翅目昆蟲細(xì)胞具有感染性。 Bacmid 含有F因子復(fù)制子( 可在大腸桿菌中復(fù)制) 、卡那霉素抗性基因及Tn7 轉(zhuǎn)座位點(diǎn)attTn7。 轉(zhuǎn)移載體中，外源基因置于桿狀病毒啟動子之下, 兩端分別為Tn7的左右端。以其轉(zhuǎn)化含Bacmid的E.coli菌株，由輔助質(zhì)粒提供反式作用發(fā)生轉(zhuǎn)座，而將外源基因轉(zhuǎn)到Bacmid的attTn7位置。,Bacmid,在Bacmid 中，外源基因被核多角體啟動子控制，并包含了多種抗性基因及LacZ 缺失標(biāo)記，極大地方便了重組病毒的篩選及鑒定。這種重組了外源基因的Bacmid轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞，可得到100%陽性重組病毒 。 操作簡單方便，只需1 周即可完成重組病毒載體的構(gòu)建。,Bacmid,由于我國有養(yǎng)蠶業(yè)，還可在AcMNPV Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，構(gòu)建能夠應(yīng)用于家蠶的BmNPV Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)，這將大大減少傳統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源重組蛋白所需時(shí)間，極大地提高了工作效率。還能夠解決培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞成本高，難于規(guī)?；a(chǎn)等問題。 重組率100%、操作簡便、1 周完成重組、全部操作都在細(xì)菌中進(jìn)行，取名為Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng),1.2 昆蟲細(xì)胞宿主,昆蟲細(xì)胞在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中被作為非常重要的研究工具。 目前全世界建立的昆蟲細(xì)胞系有800 多株，分別來源于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目、同翅目和半翅目8 個(gè)目的170 余種昆蟲，其中具有實(shí)際應(yīng)用的細(xì)胞系大部分來自鱗翅目和雙翅目。 以昆蟲桿狀病毒為載體的昆蟲細(xì)胞可成功、高效地表達(dá)外源基因，生產(chǎn)具有重要藥用價(jià)值和具備天然活性的重組蛋白。因此，在眾多昆蟲細(xì)胞系中鱗翅目昆蟲細(xì)胞系應(yīng)用最為廣泛。,1.2 昆蟲細(xì)胞宿主,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)既可在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中，又可在昆蟲和蛹內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。究竟在昆蟲體內(nèi)還是在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)外源基因，可根據(jù)外源蛋白的性質(zhì)及其用途、表達(dá)水平高低、分離純化難易、純化要求高低等因素來考慮。 然而，對于常規(guī)小量及高純度的蛋白質(zhì)生產(chǎn)而言，利用體外培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞來進(jìn)行表達(dá)是首選途徑。 相對于已知的上百萬種昆蟲以及昆蟲細(xì)胞系的廣泛用途來說，已經(jīng)建立的細(xì)胞系還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，仍需建立更多的昆蟲細(xì)胞系以滿足實(shí)際需要。,Company Logo,2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),安全性高,基因容量大,表達(dá)水平高,能進(jìn)行翻譯后的加工修飾,重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能,2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),相對其他表達(dá)系統(tǒng)它具有以下幾個(gè)方面的特點(diǎn)： 重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可為高表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。 利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)富含二硫鍵的一些具有神經(jīng)毒性的生物毒素肽將是一個(gè)最佳的選擇。,2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有對蛋白質(zhì)完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、?；⑿盘栯那谐半亩蔚那懈詈头纸獾?，修飾的位點(diǎn)與天然蛋白在細(xì)胞內(nèi)的情況完全一致。 對比實(shí)驗(yàn)證明，在昆蟲細(xì)胞發(fā)生的糖基化位點(diǎn)與哺乳動物細(xì)胞中完全一致，但修飾的寡糖種類卻不完全一樣。這種不一致對不同目的蛋白的活性影響不同，所以昆蟲表達(dá)系統(tǒng)還可作為一個(gè)研究糖基化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能影響方面的理想模型。,2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),表達(dá)水平高：與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)就是能獲得重組蛋白高水平的表達(dá)，最高可使目的蛋白的量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50。 雖然目前科研工作者大都是在細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行表達(dá)外源基因，當(dāng)條件成熟時(shí)需要大量制備某類外源蛋白時(shí)，最好采用昆蟲幼蟲或蛹。因?yàn)榕囵B(yǎng)昆蟲幼蟲和蛹遠(yuǎn)比培養(yǎng)細(xì)胞簡單、廉價(jià)，而且利用昆蟲幼蟲或蛹能夠顯著提高外源基因的表達(dá)水平。 利用BmNPV 載體在家蠶幼蟲中成功表達(dá)出重組蜘蛛牽引絲蛋白，表達(dá)量高達(dá)每個(gè)昆蟲活體6mg。一般在幼蟲體內(nèi)的淋巴液中，蛋白質(zhì)表達(dá)量較在細(xì)胞培養(yǎng)基中高10倍以上。因此，通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可利用昆蟲活體大規(guī)模生產(chǎn)各種重組蛋白。,2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),基因容量大：昆蟲桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為80 200kb，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。DNA 復(fù)制后組裝在桿狀病毒的毒粒內(nèi)，由于毒粒具有較大的柔韌性，能包裝較大的基因片段，可表達(dá)非常大( 100kb) 的外源性基因。因此是表達(dá)大片段DNA 的理想載體。但目前尚無實(shí)驗(yàn)得知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。 我們感興趣的另外一個(gè)特點(diǎn)是在昆蟲桿狀病毒載體內(nèi)還可多基因同時(shí)表達(dá)，具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力。根據(jù)設(shè)計(jì)需要既可采用不同的重組桿狀病毒同時(shí)感染細(xì)胞的形式，也可在同一桿狀病毒載體上同時(shí)克隆多個(gè)外源基因，其表達(dá)產(chǎn)物之間可有蛋白質(zhì)的相互作用或加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。,2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),安全性高：由于桿狀病毒的天然宿主是昆蟲，不能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制病毒DNA 以及增殖病毒，桿狀病毒不會感染人。因此對細(xì)胞的生理影響較哺乳類病毒載體要小，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作者的自身安全也比較有保障。 現(xiàn)有研究也表明其啟動子在哺乳動物細(xì)胞中沒有活性，因此在表達(dá)癌基因或有潛在毒性的蛋白質(zhì)時(shí)可能優(yōu)于其他表達(dá)系統(tǒng)。最新研究發(fā)現(xiàn)，AcMNPV 病毒作為哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體，也可以將外源基因?qū)氩溉閯游锏募?xì)胞，如人的肝細(xì)胞。這意味AcMNPV 病毒可能成為哺乳動物基因治療的媒介體，因此桿狀病毒有望在未來人類的基因治療中得到應(yīng)用。,3.昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)、重組病毒殺蟲劑等眾多領(lǐng)域中。其中，在生物分子研究中，具有代表性的是重組蛋白的表達(dá)，是目前桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最多的領(lǐng)域。成功表達(dá)出具有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)又可用于藥物研發(fā)和疫苗生產(chǎn)。,3.1 基礎(chǔ)研究,功能基因組學(xué)（functional genomics）的重要內(nèi)容是研究基因組內(nèi)各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)和核酸之間的相互關(guān)系。 實(shí)現(xiàn)這一計(jì)劃的前提是要生產(chǎn)幾萬種蛋白質(zhì) ，這就要求蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)提供新的技術(shù)，諸如：通過簡單的操作，生產(chǎn)各種活性形式的蛋白質(zhì)簡化操作過程，縮短從基因生產(chǎn)蛋白質(zhì)的時(shí)間以簡便的操作，同時(shí)生產(chǎn)許多種蛋白質(zhì)。 最新的研究和技術(shù)發(fā)展業(yè)已表明，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是解決上述問題的優(yōu)良系統(tǒng)，以昆蟲蟲體為宿主是十分有魅力的。 日本片倉公司在這方面進(jìn)行了卓有成效的探索導(dǎo)入Invitrogen公司的GATEWAY系統(tǒng) ，利用Bac-to-Bac系統(tǒng)的載體，通過單一的LR Clonase就能同時(shí)構(gòu)建各種帶目的基因的BEVS質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體；用缺失增殖所必須的線型化病毒DNA、含缺失增殖所必需基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體和外源基因同時(shí)感染蠶蛹，通過此法，不用篩選就能在短期內(nèi)獲得正確的重組病毒和目的蛋白，由于使用的是蠶蛹，這種技術(shù)還可以自動化操作。,3.2開發(fā)醫(yī)用疫苗和藥物,由BEVS生產(chǎn)的疫苗研究早已開始，HIV疫苗于20世紀(jì)80年代 ,瘧疾疫苗于90年代進(jìn)人臨床 ,但由于這2種疾病的特殊性，所有其他來源的疫苗都缺乏良好保護(hù)性，所以未能被使用。 盡管如此，臨床試驗(yàn)亦證明了昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來源的重組蛋白對人是安全的。由家蠶宿主昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組多膚藥物國內(nèi)外尚無產(chǎn)品，其主要障礙在于這是一個(gè)新的宿主系統(tǒng)，且發(fā)達(dá)國家無養(yǎng)蠶業(yè)。國內(nèi)口服重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)多膚藥物已有開發(fā)，正進(jìn)人藥物審批階段，相信昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組多膚生產(chǎn)醫(yī)用藥物會有較好的前景。,3.3 產(chǎn)業(yè)化,在眾多應(yīng)用中，重組病毒殺蟲劑作為一類重要的具有開發(fā)潛力的生物殺蟲劑，將是未來最容易產(chǎn)業(yè)化的一條成功之路。 昆蟲桿狀病毒具有宿主專一、致病力強(qiáng)、傳播快、無殘留、無抗藥性、對脊椎動物和植物安全、不易引起廣泛規(guī)模的生態(tài)平衡的破壞等特點(diǎn)。昆蟲桿狀病毒作為生物殺蟲劑第一次進(jìn)入市場在20 世紀(jì)70 年代，當(dāng)時(shí)是直接使用野生型病毒。實(shí)踐表明，生物殺蟲劑與化學(xué)殺蟲劑相比，具有殺蟲速度慢、殺蟲譜窄、成本高等缺點(diǎn)。故使病毒殺蟲劑的商品化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用受到了很大限制。為此，科研人員通過基因工程方法改造桿狀病毒，不僅可以克服野生型病毒的固有缺點(diǎn)，而且為擴(kuò)大病毒殺蟲功能提供了潛在可能。,參考文獻(xiàn),朱幫福,盧茲凡.昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2002,18(6):681-683. 高炳淼,李寶珠,于津鵬,胡遠(yuǎn)艷,長孫東亭,羅素蘭. 外源基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá).