N-乙酰半胱氨酸治療 D-氨基半乳糖誘導豬急性肝衰.doc

精品論文大集合n-乙酰半胱氨酸治療 d-氨基半乳糖誘導豬急性肝衰竭對血氨、內(nèi)毒素和細胞炎癥因子的影響研究1任鋒 1，2，丁美 1，趙軍 1，張晶 1，陳煜 1，武志明 2，段鐘平 11 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院人工肝治療和培訓中心，北京（100069）2 北京市衛(wèi)生局肝炎研究所，北京（100069）email：摘要：目的探討 n-乙酰半胱氨酸治療 d-氨基半乳糖誘導豬急性肝衰竭對肝臟功能和炎癥因子的影響； 方法 隨機將 14 只雌性中國實驗小型豬分為急性肝衰竭組（6 只）和藥物 治療組（8 只）；急性肝衰竭組和藥物治療組分別應用 d-氨基半乳糖（1.2g/kg）靜脈滴注制 備藥物性急性肝衰竭動物模型；藥物治療組給予 n-乙酰半胱氨酸治療，急性肝衰竭組同期 給予相同劑量的生理鹽水；分別采用測定動物血氨、血漿內(nèi)毒素以及血清中腫瘤壞死因子-、 白介素-1 含量。結(jié)果藥物治療組和急性肝衰竭組相比，血氨和炎癥細胞因子 tnf-、il-1 水平在 24 和 48 時間有明顯改善， 在 12 和 60 小時沒有顯著性差異；內(nèi)毒素水平在 12 小時 有明顯改善，但 12 小時后沒有顯著性差別。結(jié)論 nac 可改善 d-氨基半乳糖誘導的豬急性 肝衰竭肝臟功能，使血氨血癥和內(nèi)毒素血癥得到一定改善，可抑制炎癥反應的快速發(fā)展，穩(wěn) 定機體的內(nèi)環(huán)境。關(guān)鍵詞：n-乙酰半胱氨酸；肝衰竭；血氨；內(nèi)毒素；細胞炎癥因子肝臟功能衰竭（liver failure，lf）是臨床上十分常見的由各種原因（病毒、酒精、藥物 及許多代謝性疾?。┧碌呐R床綜合征，歐美國家以藥物（如對乙酰氨基酚）為主，我國則 以病毒（主要是乙型肝炎病毒）為主。n-乙酰半胱氨酸（n-acetylcysteine, nac）是細胞內(nèi) 還原型谷胱甘肽（gsh）的前體，具有廣泛的生物學效應。目前在我國不同原因引起的急性 肝功能衰竭均可見到，因此根據(jù)乙酰半胱氨酸在抗氧化、解毒、改善微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)等方 面的作用，我們采取與人類各項生理、生化指標比較接近的大型動物豬為研究對象，應用 nac 治療以 d-氨基半乳糖誘導建立的急性肝衰竭動物模型1，以觀察 nac 治療非對乙酰氨 基酚引起的急性肝衰竭的效果以及藥物作用機制。本文在前期研究結(jié)果2的基礎(chǔ)上進一步談 討 n-乙酰半胱氨酸治療豬藥物性肝衰竭對血氨、內(nèi)毒素和細胞炎癥因子的影響。1. 材料和方法1.1實驗材料中國實驗小型豬（五指山小型豬系近交系）14 只，雌性，78 月齡，體重在 1825 公斤之間，購自中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學動物中心的標準實驗環(huán)境 中。nac 由杭州民生藥業(yè)集團有限公司提供。1.2急性肝衰竭動物模型的建立動物采用鹽酸氯胺酮 10mg/kg，安定 10mg 肌肉注射實施基礎(chǔ)麻醉并以 10%丙泊酚緩慢 靜點維持麻醉狀態(tài)，經(jīng)右側(cè)頸外靜脈插入大口徑雙腔中心靜脈導管。靜脈注射 d-氨基半乳 糖（給藥劑量為 1.2g/kg），于 10 分鐘內(nèi)快速輸入動物體內(nèi)。1 本課題得到北京市教育委員會科技發(fā)展計劃項目(km200610025030)的資助。- 3 -1.3動物分組和治療給藥方法中國實驗小型豬 14 只動物隨機分為 2 組：急性肝衰竭組（6 只）和藥物治療組（8 只）； 藥物治療組于靜脈導管滴注 d-氨基半乳糖后 6 小時，24 小時，48 小時分別給予 nac 150 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg 進行治療；急性肝衰竭組同期給予相同劑量的生理鹽水；1.4觀察指標1.4.1肝臟功能指標 alt、ast、tbil 的檢測以 d-氨基半乳糖給藥前為 0 小時、給藥后 12 小時、24 小時、48 小時、60 小時，采血5ml 進行生化常規(guī)指標檢測，檢測的肝功指標主要有谷草轉(zhuǎn)氨酶（alt）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ast）、 總膽紅素（tbil）。1.4.2血氨和內(nèi)毒素的檢測兩組研究對象于 d-氨基半乳糖給藥前為 0 小時、給藥后 12 小時、24 小時、48 小時、60 小時，分別留取 2 ml 靜脈血進行血氨和內(nèi)毒素的檢測。將全血置于專用瓶內(nèi)搖勻后測定 其血氨濃度，具體操作按照試劑說明步驟進行；血氨分析試劑盒名稱為 ammonia test kit ，儀器及試劑盒購自日本 arkray factory inc。血漿中的內(nèi)毒素測定應用內(nèi)毒素鱟試 驗試劑盒，采用鱟試劑的合成基質(zhì)偶氮顯色法原理，操作過程中使用的試劑和器材和操作步 驟嚴格遵照試劑盒說明書要求進行。1.4.3細胞因子 tnf-、il-1 的檢測以 d-氨基半乳糖給藥前為 0 小時、給藥后 12 小時、24 小時、48 小時、60 小時，留取 靜脈血標本 2000 轉(zhuǎn)/min 離心 10 分鐘后，提取血清用于檢測細胞因子 tnf-、il-1。應用 酶聯(lián)免疫吸附實驗方法（elisa）進行檢測，酶聯(lián)板包被的分別為豬的特異性 tnf-、il-1 單克隆抗體。elisa 方法具體步驟按照說明書操作步驟進行。1.5 統(tǒng)計學方法各檢測指標的數(shù)據(jù)均采用均數(shù)標準差表示，采用 spss11.5 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理， 兩組之間各個時間點治療前后的比較應用獨立樣本比較的秩和檢驗，p 0.05 為有統(tǒng)計學意 義。2. 結(jié) 果2.1nac 治療對 alt，ast 和 tbil 的影響急性肝衰竭組和藥物治療組動物給予 d-氨基半乳糖后肝功能損傷均呈現(xiàn)進行性加重， 但治療組與對照組相比，治療組動物在給予 nac 治療后，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶、 總膽紅素下降，在 12，24 和 48 小時大部分時間點差異有統(tǒng)計學意義，但 60 小時時間點則 很少有差異統(tǒng)計學意義（如表 1 所示）。表 1 急性肝衰竭組和藥物治療組不同時間點 alt, ast 和 tbil 測定值組別時間谷丙轉(zhuǎn)氨酶（u/l）谷草轉(zhuǎn)氨酶（u/l）總膽紅素（umol/l）急性 肝衰竭組藥物 治療組12 小時89.523.5247.337.913.12.524 小時242.630.5900.748 小時1217.368.42061.9101.586.210.560 小時1826101.22573.0120.8197.823.412 小時77.218.5*304.3*24 小時211.134.4*1349.6120.3*32.55.948 小時1069.148.71517.354.8*79.710.7*60 小時168154.11754.149.1*172.535.1注：* 治療組與對照組治療前后各時間點比較具有顯著性差別（p0.05）；2.2nac 治療對血氨和內(nèi)毒素的影響研究結(jié)果表明，急性肝衰竭組和藥物治療組給予 d-氨基半乳糖后血氨和內(nèi)毒素水平明 顯升高；藥物治療組給予 nac 治療后與急性肝衰竭組相比能有效降低血氨和內(nèi)毒素水平： 血氨在 24 小時和 48 小時有顯著性差異（p0.05），內(nèi)毒素在 12 小時和 24 小時有顯著性差 異（p0.05），如圖 1 所示。圖 1 急性肝衰竭組和藥物治療組學血氨和血漿內(nèi)毒素水平動態(tài)變化趨勢；a 血氨水平動態(tài)變化；b 血漿 內(nèi)毒素水平動態(tài)變化2.3nac 治療對 tnf-, il-1 影響給予 d-氨基半乳糖后，急性肝衰竭組和藥物治療組隨著時間延長，細胞因子 tnf-， il-1 均呈升高趨勢。藥物治療組 tnf- 水平在 12，24，48 時間觀察點與急性肝衰竭組相 比均有下降， 并且差異均有顯著性意義（p0.05）；藥物治療組 il-1 水平在 12，24，48，60 時間觀察點與急性肝衰竭相比均有下降， 12 小時和 24 小時 il-1 水平差異具有顯著性 意義（p0.05）（如圖 2 所示）。圖 2 急性肝衰竭組和藥物治療組學血清腫瘤壞死因子-和白介素-1 水平動態(tài)變化趨勢；a 血清 tnf-水平動態(tài)變化；b 血清 il-1 水平動態(tài)變化；3. 討 論乙酰半胱氨酸( acetylcysteine，nac)是一種巰醇化合物，其化學式為 c5h9no3s，分子 量為 163.2。nac 是細胞內(nèi)谷胱甘肽（gsh）的前體，具有廣泛的生物學效應：nac 可 提高機體內(nèi)谷胱甘肽（gsh）含量，半胱氨酸上的巰基是谷胱甘肽活性基團，gsh 具有解 毒、抗氧化等多種重要功能。nac 作為小分子物質(zhì)，易于進入細胞，脫乙酰基后成為 gsh 合成的前體，促進 gsh 的合成，提高組織內(nèi) gsh 含量，增強組織的抗自由基及抗藥物、毒 物損傷的能力；nac 的抗生物氧化作用 nac 分子中含有活性巰基（sh），可對抗不同 原因所致的組織氧化損傷。對體內(nèi)氧自由基（超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等）具有明 顯的拮抗作用；由于 nac 易進入細胞內(nèi)，對能透過細胞膜與多種細胞成分（如蛋白質(zhì)、dna、 氨基酸等）反應、導致肝細胞損傷壞死的氧自由基（(h202、-oh）具有抑制、清除作用。 nac 在體內(nèi)能作為一氧化氮分子載體并增加 no 的生物利用度，發(fā)揮 no 生理效應，促進 收縮的微循環(huán)血管擴張，有效增加血液對組織氧輸送和釋放，糾正組織缺氧，防止細胞進一 步壞死，降低多器官功能衰竭的發(fā)生率，從而提高器官衰竭的存活率。除此以外，nac 具 有預防 dna 損傷、調(diào)整基因的表達和信號轉(zhuǎn)導的功能，還具有抗細胞凋亡、抗血管生成、 抑制惡性腫瘤發(fā)展等作用35。由于我國重型肝炎最常見的病因是由肝炎病毒引起，其中 80以上是由 hbv 感染引起， 而在慢性肝炎或肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生慢性重型肝炎相當常見。關(guān)于 nac 在慢性重型肝炎中的 應用國內(nèi)外已有初步研究，結(jié)果顯示該藥物對重型肝炎的治療有一定的療效68。國外臨 床研究證明靜脈應用乙酰半胱氨酸不僅是治療醋氨酚過量引起的肝衰竭，對其他病因引起的 肝衰竭也顯示良好療效。因此根據(jù)乙酰半胱氨酸的解毒、抗氧化、改善微循環(huán)等作用，研究 其對非醋氨酚引起肝衰竭的治療作用。本次研究結(jié)果表明，急性肝衰竭組動物血清 alt、 ast 和 tbil 水平明顯升高, 病理學也同時證實有嚴重肝損傷表現(xiàn)2。研究結(jié)果顯示 nac 對 衰竭的肝臟功能恢復起到一定的作用：藥物治療組在給予 nac 后，與急性肝衰竭組相比， 肝功能指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素在 12，24，48 小時明顯下降。在急性肝衰竭的致病機理中，細胞因子發(fā)揮著重要的作用。tnf- 是一種具有廣譜生 理和病理效應的細胞因子，主要由單核和巨噬細胞分泌；低水平的 tnf- 是肝細胞生長分- 3 -化與再生所必需的調(diào)節(jié)因子，高水平的 tnf- 可以與細胞膜上 tnf 受體結(jié)合，激活caspase-3，誘發(fā)肝細胞凋亡，引起炎癥細胞浸潤及肝組織壞死，是肝衰竭的重要病理機制； 因此 tnf- 是造成肝細胞損傷的主要因子，是機體炎癥反應和一系列病理生理過程的重要 介質(zhì)，與肝細胞炎癥、壞死及病情發(fā)展密切相關(guān)9,10。il-1 是一種來源廣泛的多功能細胞 因子, 參與多種炎癥反應, 促進組織損傷；il-1 能誘導其他炎癥細胞因子、趨化因子、黏附 分子等的合成，是局部和全身炎癥反應中起重要作用的促炎因子之一；除直接作用外，il-1 還可通過與其他促炎癥因子的共同作用，導致所謂“炎癥級聯(lián)效應”的產(chǎn)生11,12。研究結(jié)果表 明，急性肝衰竭動物的血清 tnf-、il-1 水平顯著升高。藥物治療組經(jīng) nac 治療后 tnf-、 il-1 水平在每個時間觀察點與對照實驗組相比均有下降，治療前后細胞因子水平差異顯著， 但在整個觀察時間內(nèi)，無論是對照實驗組和治療實驗組，細胞因子都是逐漸升高。該結(jié)果說 明 nac 治療可以減少體內(nèi) tnf-、il-1 炎癥細胞因子的生成，抑制炎癥反應的快速發(fā)展， 穩(wěn)定機體的內(nèi)環(huán)境，減輕肝臟損傷，為肝細胞的再生、修復提供條件。在這里需要指出的是，從急性肝衰竭組和藥物治療組之間的肝功能指標、血氨、內(nèi)毒 素以及炎癥細胞因子進行比較時發(fā)現(xiàn)，在 24 小時和 48 小時觀察點時治療組和對照組的差別 一般具有顯著的統(tǒng)計學意義，這種現(xiàn)象提示 48 小時以后，實驗對象的肝臟功能隨著肝衰竭 的進展發(fā)生了急劇的變化，這也提示我們在治療臨床急性肝衰竭患者時，應早發(fā)現(xiàn)，早治療， 以保證達到良好的治療效果。綜上所述，nac 作為細胞內(nèi)谷胱甘肽的前體，一種含有巰基的抗氧化劑，對非醋氨酚 引起的急性肝功衰竭同樣具有一定的療效：改善肝臟的一般狀況和機能，并且可以抑制炎癥 細胞因子的生成，抑制炎癥反應的快速發(fā)展，在一定程度上為肝臟功能的恢復提供有益的幫 助。參考文獻1李亞明,張晶,趙軍等. 急性肝功能衰竭動物模型的建立. 肝臟,2006,11(3):175-177.2喬玲,任鋒,張培豪等. n- 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