白血病細(xì)胞的免疫分型

白血病細(xì)胞的免疫分型白血病細(xì)胞的免疫分型 正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為功能細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原的出現(xiàn) 、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及其分化程度相 關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別和分類(lèi)血細(xì)胞的基礎(chǔ)。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫 瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對(duì)白 血病進(jìn)行免疫分型。由于白血病細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的特征，其抗原表達(dá)又不完全同于正常血細(xì)胞，?？?出現(xiàn)某些抗原缺乏、過(guò)度表達(dá)、系列交叉表達(dá)某一系列或階段不應(yīng)有的抗原，這又增加了白血病免疫分 型的復(fù)雜性。 近年來(lái)白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。國(guó)際上公認(rèn)的通用的方 法是流式細(xì)胞術(shù)（FCM），此外還有免疫組化法，電鏡和熒光顯微鏡也可以幫助診斷。其中流式細(xì)胞術(shù)（ FCM）和免疫組化法較為常用。 流式細(xì)胞術(shù)中，白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數(shù)分析白 血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度 。因?yàn)?FCM 能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測(cè)定細(xì)胞膜，漿，核的抗原表達(dá)。另一個(gè)重要理由是至 今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。所以能用正常血細(xì)胞的單抗來(lái)進(jìn)行免疫分型是基于白血病形成的分化阻 斷學(xué)說(shuō)即白血病細(xì)胞基因異常，分化受阻于某階段形成不同亞型的白血病。這群細(xì)胞充盈于骨髓?？乖?表達(dá)與其相應(yīng)系列/階段的血細(xì)胞無(wú)明顯差異。與形態(tài)學(xué)檢查相似僅能根據(jù)數(shù)量的差異來(lái)判斷病變細(xì)胞的 屬性。單參數(shù)免疫標(biāo)志測(cè)定易將正常細(xì)胞包括在內(nèi)。因此，近年來(lái)主張用設(shè)門(mén)（gating）方法。即用 CD4 5 與側(cè)向角（side scatter,SSC），對(duì)數(shù)取樣后可將骨髓細(xì)胞清晰地分出淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì) 胞，幼稚細(xì)胞和紅細(xì)胞群，其理論依據(jù)是 CD45 是所有白細(xì)胞的抗原。其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì) 胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞（blasts）依次減弱。紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá) C D45。SSC 反映細(xì)胞的顆粒性，成熟粒細(xì)胞 SSC 最高，依次為單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，blasts，紅細(xì)胞。以 CD45/SSC 雙參數(shù)，對(duì)數(shù)取樣時(shí)即可把各細(xì)胞群區(qū)分出來(lái)。若同時(shí)加上一個(gè)，二個(gè)甚或三個(gè)熒光標(biāo)記的單 抗，則很容易識(shí)別非正常細(xì)胞群所表達(dá)的抗原。這樣可以排除正常細(xì)胞的干擾。在幼稚細(xì)胞低的情況 下或檢測(cè)殘存白血病時(shí)尤為必要 。FCM 分析白血病免疫表型時(shí)，測(cè)量細(xì)胞數(shù)量一般在 1000050000 細(xì)胞 之間，而且快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對(duì)白血病的診斷 與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。 細(xì)胞免疫化學(xué)是細(xì)胞化學(xué)吸收了免疫學(xué)的理論和技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)重要方法學(xué).在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 中被廣泛應(yīng)用.尤其在細(xì)胞學(xué)中該技術(shù)的應(yīng)用是微觀世界形態(tài)學(xué)研究從單一的形態(tài)學(xué)描述上升到結(jié)構(gòu)、功 能和代謝為一體的動(dòng)態(tài)觀察。并可對(duì)細(xì)胞的屬性、分化階段和變異進(jìn)行鑒別，有助于臨床疾病的診斷。 細(xì)胞免疫標(biāo)記技術(shù)的方法學(xué)建立至今僅為短短 30 年左右的時(shí)間，但其發(fā)展異常迅速，檢測(cè)方法可多達(dá) 20 多種以上。其基本原理是將組織和細(xì)胞作為抗原，與其相應(yīng)的特異抗體產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，并借助熒 光色素、酶、膠體金、鐵蛋白等顯示系統(tǒng)，在被測(cè)組織和細(xì)胞所相應(yīng)的位置顯示出來(lái)。由于抗原抗體 系統(tǒng)具有高度的特異性和敏感性，能夠?qū)⒓?xì)胞形態(tài)學(xué)和功能代謝緊密的結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行觀察和分析。免 疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效，快速催化作用彼此結(jié)合，由此形成一種既 具有免疫熒光、放射免疫的優(yōu)點(diǎn)，又避免了他們的缺點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)的原理和操作與熒光法有許多相似之 處，所不同的是用酶來(lái)替代熒光素作為標(biāo)志物，并采用底物被酶分解后的顯色反應(yīng)來(lái)顯示抗原抗體的結(jié) 合與否。 作為血液學(xué)中的細(xì)胞免疫組化染色，應(yīng)該首選堿性磷酸酶(AP)顯色系統(tǒng)。 因?yàn)樵谘汉凸撬杓?xì)胞中 有一部分細(xì)胞含有非常豐富的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，雖然在操作時(shí)可采取一些措施來(lái)抑制細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物 酶，但這種處理比較粗糙，往往不能完全抑制該細(xì)胞內(nèi)源酶的活性,又可造成部分細(xì)胞表面抗原的破壞或 丟失。而對(duì)血液系統(tǒng)中許多惡性疾病的診斷，通常是檢測(cè)其細(xì)胞表面的分化抗原。再則在血液和骨髓組 織中，還存在大量的成熟紅細(xì)胞。其中的血紅蛋白對(duì)本法也會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的干擾，(因血紅蛋白具過(guò)氧化物 酶的功能)，可對(duì)被檢標(biāo)本的背景產(chǎn)生難以去除的非特異性染色。從而導(dǎo)致結(jié)果難以判斷。 這里就以流式細(xì)胞術(shù)為主要研究方法對(duì)白血病細(xì)胞的免疫分型進(jìn)行闡述。 骨髓血細(xì)胞是形態(tài)學(xué)分型的基礎(chǔ)，F(xiàn)CM 白血病免疫分型是對(duì)形態(tài)學(xué)分型的重要補(bǔ)充和進(jìn)一步深化，國(guó) 際白血病 MIC 分型協(xié)作組認(rèn)為免疫分型對(duì)每一例急性白血病都是必不可少的，對(duì)下列情況意義更大：1、 用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來(lái)源的白血病。2、形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）或急性 未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。3、混合性白血病。4、部分髓系白血病。目 前，免疫分型對(duì)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。5、慢性淋巴細(xì)胞白血病。6、微小殘留 白血病。 免疫分型常用的免疫標(biāo)志及其意義 白血病系列分化抗原 T 淋巴細(xì)胞白血?。篊D3、CD5、CD7。 B 淋巴細(xì)胞白血?。篊D10、CD19、CD22。 NK 淋巴細(xì)胞白血?。篊D16、CD56、CD57。 髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO（髓過(guò)氧化物酶）。 紅白血?。篏lyA（血型糖蛋白 A）。 巨核細(xì)胞白血?。篊D41、CD42、CD61。 白血病系列非特異性抗原 CD34、HLADR 為早期細(xì)胞抗原，無(wú)系列特異性，可與 CD38 聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型。一般而言，干/祖 細(xì)胞 CD34、HLADR、CD38，原始細(xì)胞 CD34、HLADR、CD38，而幼稚細(xì)胞（如早幼粒細(xì)胞 ）CD34、HLADR、CD38。 白血病分化階段抗原 T 細(xì)胞抗原 CD4、CD8。 B 細(xì)胞抗原：CD10、Cy（胞漿 鏈）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38 和 CyIg（胞漿免疫球蛋 白）、CD11C。 白細(xì)胞共同抗原 CD45 為白細(xì)胞共同抗原，但原幼細(xì)胞表達(dá)量比成熟淋巴細(xì)胞低，幼紅細(xì)胞不表達(dá)。用 SSC/CD45 PerC P 雙參數(shù)分析可十分容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細(xì)胞。用兩個(gè)系列或階段特異性 McAb 加 CD45 進(jìn) 行三色免疫熒光染色，經(jīng) FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP 五參數(shù)分析，可特異地分析原 幼白血病細(xì)胞的免疫表型而不受成熟細(xì)胞的干擾。 白血病的免疫分型 一、AML MO、 Mo blasts 有低的 SSC 和 FSC。在 CD45SSC 圖上出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞位置上，至少表達(dá)一個(gè) 特異性標(biāo)志如 CD13 或 CD116，但 MPO 比 CD13 與 CD33 更靈敏。一般淋系標(biāo)志陰性，但也可表達(dá) CD7 或 CD4。Mo blasts 一般 HLADR、CD34 陽(yáng)性，有些研究表明 CD7 與 CD34 共表達(dá)在 AML 且預(yù)后差。 M1、 流式上 M1 與 M0 相似不易區(qū)分，M1 一般 CD13、CD33、HLADR，但 CD34 表達(dá)少于 M 0，可能表達(dá)部分 CD15。 M2、 M0 與 M1 的主要區(qū)別是成熟度增加，blasts 減少，CD15 較 M1 較顯著，CD34 弱于 M1，CD13 有時(shí)表達(dá)強(qiáng)于 CD33，多數(shù)病例 HLADR（-）。CD45SSC 圖顯示從髓系 blast 區(qū)至成熟骨髓細(xì)胞區(qū) 的連續(xù)細(xì)胞帶，CD45SSC 圖有助于確定 blasts 比例。 M3、高顆粒性，具較高的 SSC，但 CD45 較成熟 C 少，多數(shù)情況 HLADR（-）或表達(dá)減少，CD34 少于 M2、一般 CD13 弱（），可有 CD2 表達(dá)。 M4 與 M5、 兩型表型相似，但 M4 較 M5 表達(dá)更多的 CD34（），較之 M0、M1，M4 與 M5 有更大 的 FSS 和 SSC，CD45SSC 圖上，成熟 C 出現(xiàn)在單核區(qū)，重要的表型為 CD13、CD33、HLADR、CD14 和 CD15，CD33 可表達(dá)強(qiáng)于 CD13，CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能為 M5，但只出現(xiàn)在少 數(shù)病人中，部分 M5 可見(jiàn) CD56（）。 M6、 M6 較少見(jiàn)且特征不明顯，一般 HLADR，CD34、CD13、CD33 陽(yáng)性，CD45SSC 圖顯示主要 為紅系成份。 綜述：白血病細(xì)胞的免疫分型 03 級(jí)交大教改班 史蔚 5031819004 - 3 - M7、 巨核細(xì)胞白血病，在 AML 中少于 1。一般 CD61（Gpa）和/或 CD41（Gpb-a）陽(yáng)性 ，而注意由于血小板粘附在 blasts 上造成的假陽(yáng)性，可以用流式雙色分析在 EDTA 存在下，測(cè) Gpb /a 與 CD34 以減少激活血小板的粘附。 二、ALL： ALL 是兒童中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全部腫瘤的 25，在成人，ALL 約占急性白血病 的 25，我們將 ALL 分為 B 祖細(xì)胞型，CD10或 CD10，前 B 細(xì)胞型，B 細(xì)胞型，T 細(xì)胞型。 B 祖細(xì)胞型 ALL：在幼兒約占 ALL 的 6570，青少年為 5560，成人為 50。在兒童 ，約 90病例 CD10，在幼兒只有少于 50病例 CD10，blasts 一般 FSC、SSC 很少，是 FAB 標(biāo)準(zhǔn) 的 L1 或 L2，一般 TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分為 2 個(gè)亞型，CD10和 CD10，前者預(yù)后 好，多數(shù)病例 CD24，CD34，CD20 表達(dá)隨成熟度增加而增加，B 祖細(xì)胞被定義為 sIg-。 前 B 細(xì)胞型 ALL：此亞型約占兒童 ALL 的 25，細(xì)胞一般為 CD19，CD24，HLADR，胞漿 CD 22，CD10，TdT 隨 CD20 變化，CD34 多為陰性，前 B 亞型被認(rèn)為比 B 祖型預(yù)后更差，這與 t(1；1 9)出現(xiàn)相關(guān)并由此產(chǎn)生 E2APBX1 融合蛋白，它的表型為 CD19、CD10、CD9，不同程度 CD20 表達(dá)，CD34，確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確定的病例。 B 細(xì)胞型 ALL：成熟 B 細(xì)胞型 ALL 約占 ALL25，B 細(xì)胞型 ALL 較之 B 祖細(xì)胞型 ALL 有更大的 FSC 和 SSC，在 CD45SSC 圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細(xì)胞區(qū)域，即 FAB 標(biāo)準(zhǔn)的 L3，表型為 CD19、CD20、 CD22、CD24 且 sIg（多數(shù)為 IGM）多數(shù)病例 CD10。但成熟抗原及 sIg 使之區(qū)別于更早的 B 系 ALL， 極少數(shù)成熟 B 細(xì)胞 ALL 無(wú) FABL3 形態(tài)。 TALL：多數(shù)病例有大的 FSC、SSC，在 CD45SSC 圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系未成 熟細(xì)胞或單核細(xì)胞區(qū)，多數(shù)表現(xiàn)為胸腺亞型，最常見(jiàn)亞型為皮質(zhì)晚期表達(dá)，CD1、CD2、CD5、CD7、CD 4/ CD8 雙陽(yáng)與極少膜表面 CD3、TdT 多為陽(yáng)性。另一常見(jiàn)亞型為皮質(zhì)早期表達(dá) CD2、CD5、CD7、TdT 強(qiáng)表達(dá)。髓質(zhì)期亞型表達(dá) CD2、CD5、CD7、與 CD3CD4/CD3+CD8+,很少見(jiàn) TdT 表達(dá)。前 T 細(xì)胞亞型 ，表達(dá) CD7 胞漿 CD3且無(wú)其它 T 細(xì)胞抗原，T 細(xì)胞腫瘤的特征是喪失 T 細(xì)胞抗原而表現(xiàn)出其它異常 抗原組合。 雜合型白血?。弘S著流式技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能?chē)?yán)格劃分為淋系或髓系，真 正的雙表型病人多為 t(9；22)或（11q23），現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分 析中未能排除非白細(xì)胞，過(guò)度強(qiáng)調(diào)弱的非特異性結(jié)合，忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要的系特 異性抗原在 B 系、T 系、髓系分別為 CD22、CD3 和 MPO。 三、CML： 由于慢性期顯著的細(xì)胞分化，在 CD45SSC 圖上除了髓系細(xì)胞占主導(dǎo)外，只顯示一個(gè)正 常 骨髓像，CML 可確診，如有 Ph1 即 t(9；22)(q34;q11)，它可形成新的雜合 BCRABL 癌基因，其產(chǎn)生 的一段 8.5kb 異常，RNA 可編碼一個(gè) 210KD（P210）的融合蛋白，使正常的造血細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?CML 細(xì) 胞，該產(chǎn)物可用 CR 擴(kuò)增后用標(biāo)記探針在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，這種分子流式技術(shù)正在研究中并將使流 式技術(shù)擴(kuò)展到分子領(lǐng)域。 CML 起病與發(fā)展相對(duì)緩慢，慢性期的持續(xù) 1 年左右最終發(fā)展為加速期和急變期。流式細(xì)胞技術(shù)對(duì) 急變期亞型的診斷具有極高價(jià)值。直接影響到治療效果。 急變期 CML 主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變 具典型形態(tài)特征，為 CD10B 祖細(xì)胞 ALL 極少有 T 細(xì)胞型 ALL。 四、CLL： CLL 細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SIgM、SIgD 弱表 達(dá)， B 系抗原為 CD19、CD20、CD43、CD79a 與 CD5 共表達(dá)，CD23 表達(dá)使得 CLL 區(qū)別于帽細(xì)胞淋巴癌 MU， 即（CLL：CD23，MCL：CD23），CD10、CD23、CD11c 和 CD25、CD20 常弱表達(dá)，盡管 CLL 起 病慢，但 CLL 病人的生存率變化很大，有染色體異常的病預(yù)后不良，最常見(jiàn)的三聯(lián)體 trisony12、14 q、13q、11q，免疫表型上沒(méi)有特異的變化而免疫表型的變化并不是提示染色體異常。最近，有研究 表明，三聯(lián)體 trisony12 與 SIg、CD20 表達(dá)量高度相關(guān)，與 CD23相關(guān) 與 FMC7 相關(guān)。 B 型前淋巴細(xì)胞白血?。˙DLL）較 CLL 更為嚴(yán)重，流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分 BDLL 和 CLL 上發(fā)揮 很大作用，BDLL 多為 CD5，CD22，表達(dá)更強(qiáng)的 sig。 MU 病人平均生存率不超過(guò) 5 年，與 CLL 在形態(tài)上很難區(qū)分，與 CLL 相似有 CD5B 祖細(xì)胞，但 Si g 表達(dá)強(qiáng)于 CLL，且 CD22。 另一與 CLL 難于區(qū)分的是 FCC，細(xì)胞為強(qiáng) Sig、CD5、CD10、CD23，具 B 系表型：對(duì)于診斷 為 CLL，CD5、FMC7、CD22 與 SIg，CD20 異常強(qiáng)表表達(dá)的病例我們要考慮是否為 DLL、MCC 或 CLL 的亞 型（trisomy12）因?yàn)樗鼈兾ｋU(xiǎn)性更大。 參考文獻(xiàn)： 1. 急性早幼粒細(xì)胞白血病免疫表型分析. 中華血液學(xué)雜志,1998,19 (1)31 2. 唐亞輝，馬葵，李次芬等。 AL 的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分型。中華血液學(xué) 雜志， 2002 ； 23 (5)； 264-266 3. 王晉芬，郗彥鳳，王