（醫(yī)學(xué)課件）病毒包裝與感染.ppt

1、,病毒包裝與感染,1,基因載體系統(tǒng),病毒載體系統(tǒng),非病毒載體系統(tǒng),腺病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,腺相關(guān)病毒載體,單純皰疹病毒載體,慢病毒載體,裸DNA,DNA-陽離子脂質(zhì)復(fù)合物,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,細(xì)胞內(nèi)包裝,細(xì)胞外包裝,DNA-陽離子多聚物,DNA/RNA嵌合物,2,基本概念：即病毒載體介導(dǎo)基因技術(shù)，一種高效的基因轉(zhuǎn)移工具，將外源基因包裝到天然病毒的外殼中，利用病毒對宿主細(xì)胞的感染性，將外源基因?qū)胩囟?xì)胞中，廣泛應(yīng)用于基因診斷和基因治療。,病毒載體系統(tǒng),3,病毒載體的優(yōu)勢,利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高； 病毒的宿主范圍廣，且具有高效的靶向特異性； 病毒基因組的結(jié)構(gòu)簡單、分子背景

2、比較清楚，穩(wěn)定易于改造、易于制備； 復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成； 不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)； 通過載體改造的方式形成了復(fù)制缺陷型結(jié)構(gòu)，安全性高； 病毒包裝技術(shù)經(jīng)歷了多年的研究，已趨于成熟，可用于產(chǎn)業(yè)化大量生產(chǎn),4,存在的問題,1、安全性：細(xì)胞毒性 染色體毒性 免疫毒性 2、靶向性：轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性 轉(zhuǎn)錄靶向性 3、有效性：轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間 表達(dá)的可調(diào)控性,5,要求：1、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒 2、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá) 3、對機(jī)體不致病 組成：1、病毒復(fù)制和包裝元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外殼/外膜,6,常用的病毒載體： 腺病毒載體、慢病

3、毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 被包裝的DNA/RNA中不含任何病毒編碼基因，只保留其復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件。獲得的重組病毒顆粒具有野生型病毒的外殼/外膜和感染性，但不表達(dá)病毒蛋白,7,8,9,腺病毒載體,無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，宿主范圍很廣，適用于在分裂或非分裂哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行高效瞬時(shí)表達(dá)。 除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞，腺病毒系統(tǒng)可以在任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效瞬時(shí)表達(dá)，是可靠的基因遞送平臺(tái)。它在感染宿主細(xì)胞時(shí)，病毒基因組及其攜帶的外源基因獨(dú)立于宿主基因組外游離表達(dá)，因此是無插入突變性，安全性高。 腺病毒載體的外源基因裝載量較大，表達(dá)速度快，可獲得高滴度的病毒?？僧a(chǎn)生108 pfu/

4、ml原液，濃縮后可達(dá)1010-1011VP/ml ，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和基因治療中。,10,腺病毒系統(tǒng)的包裝,目的基因克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒（Pshuttle-CMV） 將穿梭質(zhì)粒線性化后與腺病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入特定的大腸桿菌中 通過Cre/loxP系統(tǒng)的作用進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒顆粒。 將篩選到的重組腺病毒運(yùn)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，利用帶有E1 基因的293 細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，一至兩周即可包裝出E1缺失的腺病毒載體，通過倍比擴(kuò)增，富集病毒顆粒。,11,慢病毒載體,慢病毒(lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，為RNA 病毒。 慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物具有嗜核

5、特性，病毒基因組通過順式作用元件運(yùn)輸至細(xì)胞核，并將要表達(dá)的基因序列整合到細(xì)胞的基因組中，從而使慢病毒可以感染并在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制,得到持續(xù)穩(wěn)定的高表達(dá)。 這一特性使慢病毒成為基因治療的轉(zhuǎn)移載體。,12,慢病毒載體的特性,慢病毒載體由慢病毒為骨架改造而來 可以高效率將目的基因整合到宿主細(xì)胞的染色體上 可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞 是理想的可以在多種細(xì)胞類型（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞和非分裂細(xì)胞）中實(shí)現(xiàn)可重復(fù)的穩(wěn)定表達(dá)的基因表達(dá)工具,13,常見的慢病毒包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficienc

6、y virus, SIV)、馬傳染性貧血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV ）和貓免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV ）。,14,HIV-1,HIV-1為單鏈RNA病毒，共有9個(gè)基因。gag、pol、env3個(gè)基因編碼病毒的基本結(jié)構(gòu)，tat、rev為調(diào)節(jié)基因，vif、vpr、vpu、nef 4個(gè)為輔助基因，編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染。,gag -群抗原基因，編碼核心蛋白基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白等 pol -多聚酶基因，編碼病毒復(fù)制所需的酶，如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶 env -包

7、膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120 及gp41，決定病毒感染宿主的靶向性 tat -基因反式激活因子，參與HIV-1基因RNA轉(zhuǎn)錄的控制 rev - 病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，能增加gag和env基因?qū)Y(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá) vif -病毒感染因子, 其作用是在一些細(xì)胞因子的協(xié)下促進(jìn)HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù) Vpr -R蛋白能使HIV在巨噬細(xì)胞中增殖 vpu -U蛋白，能促進(jìn)HIV從細(xì)胞膜上釋放 nef -負(fù)因子，具有抑制HIV-1增殖作用 LTR -兩端長末端重復(fù)序列，內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件，如包裝信號(hào)元件。,15,慢病毒載體系統(tǒng)組成,第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表。該系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒

8、及載體質(zhì)粒3種質(zhì)粒組成。 包裝部分HIV-1前病毒基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用元件, 5端LTR由巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子取代，3LTR由SV40 polyA序列取代。,包裝載體,16,表達(dá)載體部分與包裝成分互補(bǔ),僅含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV-1順式作用元件, 5端LTR和全部5端非翻譯區(qū)域。 包膜表達(dá)質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來代替了原病毒的env基因。,表達(dá)載體,包膜載體,17,三代慢病毒載體,第二代慢病毒載體系統(tǒng)是在第一代的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn) 在包裝質(zhì)粒中刪除了HIV的所有輔助基因（vif、vpr、vpu和nef） 不影響病毒的滴度和感染能力，同時(shí)

9、增加了載體的安全性 第三代慢病毒載體系統(tǒng)由四質(zhì)粒代替原有的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。 將rev基因單獨(dú)放在一個(gè)包裝質(zhì)粒上。 增加了兩個(gè)安全特性：一是構(gòu)建自身失活的慢病毒載體，即刪除了U3區(qū)的3LTR，使載體失去HIV-1增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列；二是去除了tat基因，用異源啟動(dòng)子序列代替，只保留了3個(gè)基因(gag、pol和rev)，更加安全。,18,lentivirus 包裝流程,將293T 細(xì)胞傳代至60%70%匯合時(shí)，用脂質(zhì)體法將4 個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。 體外培養(yǎng)24 小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察，大量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。 培養(yǎng)48小時(shí)后，用超速離心收獲含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，濃縮后得到高

10、滴度的慢病毒濃縮液。并進(jìn)行感染293T 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，感染4872 小時(shí)后觀察到約有70%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，說明病毒用很強(qiáng)的感染能力。 將被感染細(xì)胞傳代1、2 和3次，在傳代細(xì)胞中依然觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明包裝的慢病毒具備感染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的能力。,19,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒即反轉(zhuǎn)錄病毒是一類RNA病毒，它能在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)過DNA復(fù)制/轉(zhuǎn)錄/翻譯等蛋白酶作用擴(kuò)增形成病毒。 逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA基因組整合在宿主染色體上的位點(diǎn)是隨機(jī)的。逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的整合是復(fù)制病毒RNA的必經(jīng)階段。只有當(dāng)受感染細(xì)胞處于細(xì)胞分裂期間，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA基因組才能接

11、觸到宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在分裂中的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。,20,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 轉(zhuǎn)染范圍廣，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的受體分布廣泛，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等; 轉(zhuǎn)入的外源基因可完全穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)，使得目的基因長期穩(wěn)定表達(dá)； 對細(xì)胞感染率高 感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變,可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因。 局限性： 只能感染分裂細(xì)胞； 能夠插入的外源基因較小，難以滿足較大基因的轉(zhuǎn)移； 載體DNA整合人宿主染色體是隨機(jī)的，并因隨機(jī)整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，從而具有引發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)； 活體直接基因轉(zhuǎn)移對病毒滴度要求高，病毒活體直接注射會(huì)受到補(bǔ)體影響而滅

12、活等問題。,21,逆轉(zhuǎn)錄病毒的親嗜性存在物種之間的差異，據(jù)此可將其分為三類： 單嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ectropic retrovirus），只感染小鼠和少數(shù)幾個(gè)品種的大鼠 兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（amphotropic retrovius），能感染小鼠的細(xì)胞，也能感染其他種屬動(dòng)物的細(xì)胞 異嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（xenotropic retrovirus），能感染多種動(dòng)物細(xì)胞，但不能感染小鼠細(xì)胞 目前使用較多的是兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒，即以兼嗜性包裝細(xì)胞包裝病毒顆粒。,22,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝原理,早期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共由兩部分組成：包裝細(xì)胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中去除了病毒顆粒形成所必需的gag

13、，pol和env基因，僅保留了復(fù)制和包裝信號(hào)。通過分子克隆技術(shù)將目的基因插入此載體上。而包裝細(xì)胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白gag、pol和env蛋白。,23,當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒，保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。,24,第一代包裝細(xì)胞 基因組整合了僅缺失包裝信號(hào)的MLV前病毒基因組，

14、包裝的病毒顆粒為單嗜性。 將其包膜蛋白env基因換成鼠4070A病毒的雙嗜性包膜蛋白，就產(chǎn)生了能分泌雙嗜性病毒的包裝細(xì)胞。但這個(gè)細(xì)胞系所含的包裝結(jié)構(gòu)僅僅缺失信號(hào)，只要它們與載體之間發(fā)生一次重組，就可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒，安全性很差。 第二代包裝細(xì)胞 前病毒基因組除了包裝信號(hào)缺失外，5LTR的5端順序也缺失，病毒剪接供體上游部位進(jìn)一步缺失，3LTR被SV40的轉(zhuǎn)錄終止多聚腺苷酸信號(hào)取代。經(jīng)過這樣的改造，包裝細(xì)胞與載體系列之間的共同順序只存在于緊接gag起始密碼子上游53bp的區(qū)域。,25,這種包裝結(jié)構(gòu)與載體結(jié)構(gòu)至少經(jīng)過二次獨(dú)立的重組才能形成有復(fù)制能力的野生型病毒，使基因治療的安全性大大提

15、高。但如用早期的載體進(jìn)行包裝，經(jīng)長期培養(yǎng)后，仍有野生型病毒產(chǎn)生。 第三代包裝細(xì)胞 幾乎將基因載體和包裝細(xì)胞間重組產(chǎn)生的野生型病毒完全消除。包裝細(xì)胞含有二個(gè)互補(bǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，二者均缺失包裝信號(hào)，且3LTR均被SV40的多聚腺苷酸化信號(hào)取代。但其中一個(gè)包裝結(jié)構(gòu)只含gag和pol基因，另一結(jié)構(gòu)只含有env基因，由二者聯(lián)合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)供載體包裝。這類包裝細(xì)胞具有更高的安全性。,26,常見的包裝細(xì)胞系,27,目前常用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成： 一個(gè)含有目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體；一個(gè)包膜蛋白載體；表達(dá) gag/pol 的輔助質(zhì)粒；以及包裝細(xì)胞系。 表達(dá)載體： 去除了野生型病毒顆粒形成所必需的結(jié)構(gòu)

16、基因，其基本結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)為： (1) 5LTR為CMV/MSV雜合啟動(dòng)子，缺失一段序列的3LTR作為終止子，不會(huì)在體內(nèi)發(fā)生重組； (2) 保留包裝信號(hào)+序列,促進(jìn)高滴度病毒產(chǎn)生。； (3) 去除了野生型病毒顆粒形成所必需的結(jié)構(gòu)基因，保證載體使用的安全性； (4) 在目的基因后用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)連接抗性基因，可以根據(jù)需要選擇不同的抗性； (5) 重組病毒基因組的大小不能超過10kb，如果太大則無法包裝成病毒。,28,包膜蛋白載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍由病毒顆粒表面的包膜蛋白(Env)決定，病毒基因組不影響其靶向性，不同的基因組可用相同的Env包被，且Env來自何種病毒，包裝出的病毒顆粒就叫該病毒

17、的假病毒。 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白如10A1、GAP70和4070A等都不穩(wěn)定，其與細(xì)胞受體的結(jié)合部位容易受離心剪切力或其它機(jī)械力破壞。此外，由這些包膜蛋白參與組成的逆轉(zhuǎn)錄病毒在進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)需要經(jīng)過一個(gè)特異性的受體配體結(jié)合過程，由此決定了一種病毒只能感染一種或一類細(xì)胞，限制了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。 包膜蛋白常用的載體主要有P10A1、pEco、pAmpo和口炎皰疹病毒-G蛋白（vesicular stomatitis virus G, VSV-G）。,29,VSV-G因其具有更廣泛的宿主范圍和更高的轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)而成為組成逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的最常用包膜蛋白載體。 VSV-G的結(jié)構(gòu)比較簡單，

18、在與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞內(nèi)之后，VSV-G蛋白瞬時(shí)表達(dá)，調(diào)節(jié)病毒通過脂質(zhì)結(jié)合及質(zhì)膜融合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，將重組病毒RNA包裝成有感染力的病毒。,包膜蛋白載體pVSV-G,30,當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。,packing,31,逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝流程,32,1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：將目的基因片段連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體； 2）包裝細(xì)胞準(zhǔn)備和病毒包裝 將293T 細(xì)胞傳代到直徑10 mm 培養(yǎng)皿，細(xì)胞匯合度達(dá)到95%以上時(shí)準(zhǔn)

19、備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1小時(shí)將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液換為不含血清的新鮮DMEM。 通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將載體質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。 3）病毒的收集 轉(zhuǎn)染后48h后第一次收集病毒上清，72h后再收集一次。 4）病毒的濃縮 使用Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices (100K NMWL)進(jìn)行濃縮。直接用于小鼠細(xì)胞感染或分裝凍存于-80。,33,病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光檢測效果 A：體外培養(yǎng)24 h；B,C:4872h；D,E,F：感染細(xì)胞傳代后1代、2代、3代,34,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染流程：,1）準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞； 2） 用含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，刺激細(xì)胞進(jìn) 入周期，有利于逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染； 3） 收集細(xì)胞，與病毒混合接種； 4） 培養(yǎng)細(xì)胞8-10 h，更換不含病毒液的培養(yǎng)基； 5）繼續(xù)培養(yǎng)12h后進(jìn)行二次感染； 6）第一次病毒感染72h后收集感染的細(xì)胞，進(jìn)行流式分選。,35,病毒滴度的測定,滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。”TU”為”trans