食品生物技術(shù)導(dǎo)論-蛋白質(zhì)工程與食品產(chǎn)業(yè)

1、第三章蛋白質(zhì)工程與食品產(chǎn)業(yè),什么是蛋白質(zhì)工程，蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生的動(dòng)機(jī)是什么。 蛋白質(zhì)工程有哪些技術(shù)手段及其對(duì)蛋白質(zhì)改造的基本原理 蛋白質(zhì)工程在食品工業(yè)中的作用。,本章主題,第一節(jié)、蛋白質(zhì)工程概述,催化功能：酶 調(diào)節(jié)功能：激素 結(jié)構(gòu)功能：細(xì)胞骨架 運(yùn)輸功能：血紅蛋白 免疫功能：免疫球蛋白 運(yùn)動(dòng)功能：鞭毛、肌肉蛋白 儲(chǔ)藏功能：酪蛋白 生物膜功能及神經(jīng)傳導(dǎo)等,蛋白質(zhì)的功能,維持生命所必須的基本物質(zhì)。 用蛋白質(zhì)診斷和治療某些疾病。 食品工業(yè)應(yīng)用蛋白質(zhì)制造各種產(chǎn)品。,蛋白質(zhì)重要性,蛋白質(zhì)分子量大，難于化學(xué)合成; 蛋白質(zhì)功能要在生理?xiàng)l件下才能發(fā)揮； 蛋白質(zhì)（酶）的專一性強(qiáng)。,蛋白質(zhì)應(yīng)用受限的原因,蛋白質(zhì)工程

2、,蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其功能關(guān)系為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾、蛋白質(zhì)修飾等分子設(shè)計(jì)，對(duì)現(xiàn)存蛋白質(zhì)加以改造，從而組建新型蛋白質(zhì)，或全新設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)的現(xiàn)代生物技術(shù)。,基因水平,蛋白質(zhì)水平,化學(xué)改性,物理改性,蛋白質(zhì)工程的技術(shù)手段,酶法水解或聚合改性,理性分子設(shè)計(jì)和定位突變,融合蛋白技術(shù),體外定向進(jìn)化,全新蛋白設(shè)計(jì),改造現(xiàn)有蛋白,初級(jí)改造：個(gè)別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入 高級(jí)改造：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接 從頭設(shè)計(jì)合成新型蛋白質(zhì),基因水平的蛋白質(zhì)工程,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系,第二節(jié)理性分子設(shè)計(jì)和定位突變技術(shù),中心法則,一、理性分子設(shè)計(jì)及其基本步聚,理性分子設(shè)計(jì),在已

3、知蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，對(duì)一段最可能影響蛋白質(zhì)功能與性質(zhì)的基因序列進(jìn)行定位突變，有目的地改變蛋白質(zhì)的某一兩個(gè)氨基酸殘基或模塊，從而構(gòu)建新的蛋白質(zhì)分子。,理性分子設(shè)計(jì)基本步聚,(1)分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶,了解其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息。 (2)確定它的功能域。 (3)分析結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系，找出關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和基團(tuán)。 (4)圍繞這些關(guān)鍵的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)提出對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的方案，并用基因工程的方法（定位突變）去實(shí)施。 (5)對(duì)經(jīng)過(guò)改造的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性測(cè)定.,定位突變,定位突變是在已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，在已知DNA序列中取代、插入或刪除選定的核苷酸，從而產(chǎn)生具有新性狀的突變蛋

4、白質(zhì)分子的一種蛋白質(zhì)工程技術(shù)。 PCR介導(dǎo)的定位突變、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變、盒式突變,二、定位突變,（一）寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變,原理：用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA分子進(jìn)行復(fù)制。 包括： Kunkel突變法 、基于抗生素的“抗性恢復(fù)”突變法、 基于去除特定限制酶切點(diǎn)的突變法，,Kunkel 突變法,純化單鏈DNA,基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變,優(yōu)點(diǎn)是保真度比重組PCR突變法高，缺點(diǎn)是操作環(huán)節(jié)復(fù)雜，周期長(zhǎng)，克隆待突變基因時(shí)會(huì)受到限制性酶切位點(diǎn)的限制。,寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變優(yōu)缺點(diǎn),（二）PCR介導(dǎo)的定位突變法,原理：利用PCR將插入和缺失的突變堿

5、基均設(shè)計(jì)在引物中，先用兩對(duì)引物分別對(duì)核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)重疊延伸產(chǎn)生帶有部分重疊序列的兩種PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)物經(jīng)過(guò)混合、變性、復(fù)性和鏈延伸后，再用一對(duì)與兩個(gè)待接片段外側(cè)互補(bǔ)的引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，從而產(chǎn)生全長(zhǎng)的異源雜合雙鏈DNA。,水溶性灰分測(cè)定方法,插入,TCGTATGATGCGA,AGCATACTACGCT,AGCAT,ACGCT,TGCGA,TCGTA,TCGTATGCGA,AGCATACGCT,TCGTATGCGA,AGCATACGCT,AGCATTGCGA,TCGTATGCGA,AGCATACGCT,TCGTATGCGA,AGCATACGCT,TCGTATGCGA,缺失,PCR介導(dǎo)

6、的定位突變優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，突變成功率100%； 缺點(diǎn)：保真性偏低；后續(xù)工作復(fù)雜。,（三）盒式突變,盒式突變，又稱片段取代法，利用目標(biāo)基因序列中適當(dāng)限制酶切位點(diǎn)，插入各種合適的突變DNA片段，用以取代目標(biāo)基因中特定DNA片段。 包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。,盒式取代誘變,盒式突變優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，突變效率高；可以一次改變多個(gè)位點(diǎn)或一個(gè)片段。 缺點(diǎn)：合成DNA片段成本高，要求合適的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)。,酶制劑的改造目標(biāo),1.增強(qiáng)穩(wěn)定性. 2.提高酶活力. 3.改變酶的選擇性.,三、 定位突變技術(shù)在酶結(jié)構(gòu)改造中的應(yīng)用,消除酶的被抑制特性,枯草芽胞桿菌蛋白酶：堿性蛋白酶 19

7、85年，美國(guó)的埃斯特爾借助寡核苷酸介導(dǎo)的定位突變技術(shù)，用19種其他氨基酸分別替代枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第222位殘基上易氧化的Met，獲得了一系列活性差異很大的突變酶。其中用Cys置換的突變型在1mol/L雙氧水中可以保持一小時(shí)以上的酶活。,T4溶菌酶及其突變體酶的特性,引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶及其突變酶在100下的穩(wěn)定性,轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性,改變酶的最適pH值條件,堿性條件下，80時(shí)使高果糖漿焦化產(chǎn)生有害物質(zhì)，反應(yīng)只能在60進(jìn)行。反復(fù)調(diào)節(jié)pH過(guò)程產(chǎn)生的鹽離子，去離子工序麻煩。,采用盒式突變技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中

8、的區(qū)域置換為堿性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH值變?yōu)樗嵝裕纯稍诟邷叵逻M(jìn)行反應(yīng)。,利用定點(diǎn)突變技術(shù)葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代時(shí)，突變體酶分解-1，4糖苷鍵和-1，6糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變,修飾酶的催化特異性,利用基因工程原理可以在實(shí)驗(yàn)室中模擬生物進(jìn)化過(guò)程。,理論來(lái)源,第三節(jié)體外定向進(jìn)化（非理性分子設(shè)計(jì)）,一、蛋白質(zhì)的體外定向進(jìn)化,蛋白質(zhì)的體外定向進(jìn)化,蛋白質(zhì)的體外定向進(jìn)化又稱為分子進(jìn)化，就是在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬自然進(jìn)化機(jī)制，對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行誘變、重組，再通過(guò)高通量篩選方法選擇出性能更加優(yōu)良的蛋白質(zhì)。 不需要已知蛋白質(zhì)

9、的結(jié)構(gòu)信息。,隨機(jī)突變+定向選擇目標(biāo)突變體,定向進(jìn)化示意圖,隨機(jī)突變+定向選擇目標(biāo)突變體,蛋白質(zhì)體外進(jìn)化的過(guò)程,1.通過(guò)隨機(jī)突變或基因重組創(chuàng)造基因多樣性，建立突變文庫(kù)； 2.突變體在適當(dāng)生物體內(nèi)表達(dá)； 3.高通量篩選檢出陽(yáng)性結(jié)果，供進(jìn)一步進(jìn)化； 4.此過(guò)程不斷循環(huán)，直至獲得預(yù)期性狀的新型蛋白。,定向進(jìn)化與自然進(jìn)化不同點(diǎn),1.進(jìn)化動(dòng)力不同 2.進(jìn)化方向不同 3.進(jìn)化速度不同,定向進(jìn)化定點(diǎn)突變的區(qū)別,定向進(jìn)化： 突變位點(diǎn)是隨機(jī)的，不確定的；突變位點(diǎn)的數(shù)目也是不確定的；突變的效應(yīng)更是不可預(yù)知的；理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學(xué)的，生物的）都可以應(yīng)用于定向進(jìn)化中突變體的產(chǎn)生。 定點(diǎn)突變：

10、 突變位點(diǎn)是確定的，突變的個(gè)數(shù)也是預(yù)知的；突變的效應(yīng)可能是已知的，也可能是未知的；定點(diǎn)突變的方法一般是以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的。,定向進(jìn)化突變體庫(kù)產(chǎn)生方法,重組：DNA改組、外顯子改組、隨機(jī)體外引發(fā)改組、合成改組 突變：容錯(cuò)PCR、隨機(jī)定位突變、交錯(cuò)延伸等方法,DNA改組,二、DNA改組,將一群密切相關(guān)的DNA序列，在DNaseI作用下，隨機(jī)酶切成許多片段，這些小片段之間有部分重疊堿基序列，可通過(guò)自身引導(dǎo)PCR重新組裝成全長(zhǎng)基因，從而建立分子多樣性文庫(kù)，對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪DNA改組模板，重復(fù)多次重排與篩選，直至獲得性狀較為滿意的突變體。,DNA重組裝原理圖,1. DN

11、aseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；2. 隨機(jī)片段變性；3. 隨機(jī)片段復(fù)性； 4. 延伸 反復(fù)重復(fù)2-4步后，可獲得全長(zhǎng)DNA片段,容錯(cuò)PCR,三、容錯(cuò)PCR,容錯(cuò)PCR是指在利用Taq聚合酶進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變的一種DNA體外進(jìn)化技術(shù)。,高通量篩選方法舉例,四、定向進(jìn)化技術(shù)在酶制劑改造中的應(yīng)用,L天冬氨酸酶(提高酶耐熱性和酶活)。 磷脂酶A1突變體（耐有機(jī)溶劑） 乙內(nèi)酰脲酶（D型底物突變成L型底物）。,第四節(jié)融合蛋白技術(shù),融合蛋白技術(shù)概念,一、融合蛋白技術(shù)的概念和用途,有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因編碼區(qū)首尾連接在一起，由同一調(diào)控序列控制所構(gòu)成的基因表達(dá)

12、產(chǎn)物，進(jìn)而表達(dá)所需的蛋白。,融合蛋白技術(shù)用途,1.為解決在大腸桿菌等原核生物中表達(dá)出具有生物活性、折疊正確的組蛋白提供了可能。 2.外源基因與宿主本身蛋白的部分序列構(gòu)成融合基因以融合蛋白的形式表達(dá)時(shí)會(huì)減低宿主細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物的降解。 3.融合蛋白技術(shù)的出現(xiàn)為研究出更多更好的基因工程靶向藥物提供了方便。,PCR介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子嵌合體形成,二、融合蛋白技術(shù)的方法,內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子嵌合體形成,融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用,三、融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用,1.雙功能酶 2.靶向藥物 3.抗菌肽,以往研究發(fā)現(xiàn) ， 在利用基因融合所構(gòu)建的大的酶分子中，如果用以構(gòu)成融合蛋白的各個(gè)酶分子的整個(gè)編碼序列均保留于新的酶分子中，則融

13、合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性。,雙功能酶,并且發(fā)現(xiàn)在這些新構(gòu)建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個(gè)酶的活性部位均未受到影響，與單個(gè)酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對(duì)于催化連續(xù)反應(yīng)的兩種或幾種酶， 利用基因融合的方法構(gòu)成的融合蛋白可產(chǎn)生“ 鄰近效應(yīng)” （proximity effect）。,研究發(fā)現(xiàn)， -半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生 NADH 的速度是同時(shí)加入這兩種酶的反應(yīng)速度的兩倍以上。同時(shí)過(guò)渡態(tài)時(shí)間縮短近四倍。,定向藥物,定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結(jié)合的配基。通過(guò)融合蛋白技術(shù)將這兩部分融合在

14、一起， 即可構(gòu)成一個(gè)具有獨(dú)特構(gòu)象與功能的蛋白質(zhì)。,特點(diǎn)：它可以特異性地與靶細(xì)胞或致病因子結(jié)合，并把藥物引導(dǎo)至病灶處，從而大大提高藥物的效力?？梢赃x擇性地殺傷相應(yīng)的抗原相關(guān)細(xì)胞或受體相關(guān)細(xì)胞，對(duì)其他無(wú)關(guān)細(xì)胞影響較少或無(wú)影響。,配基常是腫瘤特異性抗體、細(xì)胞因子或激素等導(dǎo)向物質(zhì)，藥物常是毒性分子（如動(dòng)植物毒素、 放療、化療藥物或細(xì)菌毒素等）。,抗菌肽,肽類抗生素又名抗菌肽，機(jī)體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其對(duì)耐藥菌的強(qiáng)大抗菌作用而受到人們關(guān)注。它廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是由生物體特定基因編碼的一類陽(yáng)離子小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，是機(jī)體天然免疫的重要組成部分。,研究結(jié)果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制 H

15、IV-1的基因表達(dá)， 減少 HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外， 也具有抗病毒的特性， 已有研究證實(shí)人源溶菌酶具有抗HIV-1的作用。 目前已有人構(gòu)建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達(dá)載體。并成功表達(dá)出了具有抗菌和抗病毒雙重活性的重組蛋白。,第五節(jié)全新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建,全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是根據(jù)所希望的得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能設(shè)計(jì)氨基酸序列稱反折疊研究。,一、概念,核心問(wèn)題是要讓設(shè)計(jì)的序列要形成一個(gè)穩(wěn)定獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)。,假如我們選定的設(shè)計(jì)目標(biāo)是水溶性的球蛋白，基本結(jié)構(gòu)圖樣是由幾段螺旋區(qū)組成的螺旋束，那么首先就要提出一個(gè)草圖，包括螺旋的數(shù)量和長(zhǎng)度，相鄰的螺旋相互平行或反平行排

16、列？相鄰螺旋之間的堆積及界面情況如何？,提出基本結(jié)構(gòu)圖樣,二、基本步聚,為了落實(shí)每個(gè)殘基位置上氨基酸，有優(yōu)先殘基的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)可供參考。對(duì)已知結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)查和分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，有些氨基酸對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)片段中的特殊位置有優(yōu)選性。,確定氨基酸順序,在初步選定了氨基酸順序之后，再用Monte Carlo 法或分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算將它的三維模型優(yōu)化，繼之以能量極小計(jì)算，使構(gòu)象的能量水平達(dá)到最低和穩(wěn)定。,結(jié)構(gòu)優(yōu)化,血紅素結(jié)合蛋白、 氧化還原活性蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合蛋白及基于蛋白質(zhì)的高分子材料。,三、取得的進(jìn)展,第六節(jié)食物蛋白質(zhì)改性技術(shù),蛋白質(zhì)的功能特性,一、蛋白質(zhì)的功能特性,1.水合特性：溶解性、分散性、溶脹性、增稠性等； 2.乳化特性：乳化性、發(fā)泡性、持水性、持油性 3.流變和質(zhì)構(gòu)性能：膠凝性、黏附性、彈性。,化學(xué)改性,二、食物蛋白的改性,主要是針對(duì)蛋白質(zhì)的一些氨基、羥基、巰基以及羧基進(jìn)行化學(xué)修飾，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、靜電荷、疏水基團(tuán)，而起到改變基功能性質(zhì)的目的。,酶法水解改性,利用蛋白酶降解食物蛋白，使其溶解性、分散性、乳化性等蛋白性能得到改善。,酶法聚合改性,利用轉(zhuǎn)谷酰胺酶對(duì)蛋白進(jìn)行聚合改性以提高食物蛋白的功能性質(zhì)。,物理改性,利用各種物理場(chǎng)效應(yīng)改變蛋白質(zhì)的功能特性。如組織化擠壓改性、高壓靜電改性、高熱高壓改性、超聲改性、高頻電場(chǎng)改性和微波改性等。,思考題,1.什么是蛋白質(zhì)工程、理性分子設(shè)計(jì)