ELISA質(zhì)量控制

1、.,1,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測法的質(zhì)量控制,.,2,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測，它的最小可測值達(dá)ng甚至pg水平，達(dá)到10-810-12g 。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。 因其方法學(xué)相對簡便，靈敏度高，特異性好，經(jīng)濟(jì)安全等特點(diǎn)而在臨床上廣泛應(yīng)用，但是由于其操作步驟復(fù)雜，一般包括試劑準(zhǔn)備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結(jié)果判定等，

2、其中任何一項(xiàng)操作不當(dāng)都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生很大影響。因此，必須加強(qiáng)ELISA檢測的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。,.,3,影響抗原抗體反應(yīng)的原因,一、反應(yīng)物自身因素 不同來源的抗體，反應(yīng)性各有差異，抗體的濃度、特異性和親和力都影響抗原抗體反應(yīng)，為提高試驗(yàn)的可靠性，應(yīng)選擇高特異性、高親和力的抗體作為診斷試劑。等價帶的寬窄也影響抗原抗體復(fù)合物的形成，單克隆抗體不適用于沉淀反應(yīng)。 抗原的理化性狀、分子量、抗原決定簇的種類及數(shù)目均可影響反應(yīng)結(jié)果。顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應(yīng)，可溶性抗原出現(xiàn)沉淀反應(yīng)，單價抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。,.,4,影響抗原抗體反應(yīng)的原因,二、環(huán)境條件 (一)電解質(zhì) 抗原與抗

3、體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過程中須有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集形成大塊的凝集或沉淀。若無電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%氯化鈉或各種緩沖液作抗原及抗體的稀釋液及反應(yīng)液。但電解質(zhì)的濃度不宜過高，否則會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。,.,5,影響抗原抗體反應(yīng)的原因,(二)酸堿度 蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點(diǎn)?？乖贵w反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)抗原抗體反應(yīng)一般在pH為69進(jìn)行。 (三)溫度 抗原抗體反應(yīng)必須在合適的溫度中進(jìn)行，一般以15

4、40為宜，最適宜反應(yīng)溫度為37。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)，對溫度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。 此外，適當(dāng)振蕩和攪拌也能促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)，其作用與反應(yīng)物粒子大小成正比。,.,6,PBS 磷酸鹽緩沖液,一般的有活性的生物制劑都要用它來稀釋,原因就是它具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用,蒸餾水不具有鹽平衡作用,可以破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物特性；生理鹽水不具有調(diào)整pH的作用,對完整的、具有活性的物質(zhì)不能保證其在最適條件下參與生物反應(yīng),所以使用PBS是首選.PBS也不是萬能的,有的生物活性物質(zhì)需要的條件比PBS還要高,就需要在平衡緩沖液中加入

5、更多的成分,維持最佳的條件保證生物活性物質(zhì)保持其最完整的特性.,.,7,1 試劑,優(yōu)質(zhì)的試劑是保證檢驗(yàn)質(zhì)量的基礎(chǔ)。近年來，國家采用批檢的形式對ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在差異，試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測水平，因此在使用之前必須對試劑進(jìn)行嚴(yán)格評估。選擇質(zhì)量好的試劑，在了解某種試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較，應(yīng)選擇靈敏度高，特異性好，精密度（CV）好（批內(nèi)CV 值小于15 %），穩(wěn)定性和安全性好，且簡便經(jīng)濟(jì)的試劑。從4冰箱取出的試劑必須放置室溫2030 min 后再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質(zhì)分子的均勻分布。未用完的試劑和質(zhì)控品

6、應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。根據(jù)蛋白質(zhì)在冷凍過程中出現(xiàn)蛋白分子分布改變的特點(diǎn)，試劑正式啟用前應(yīng)充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配制的緩沖液等，都必須調(diào)整其pH 值和離子強(qiáng)度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件，嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免試劑批號改變而重建質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性。,.,8,2 標(biāo)本,患者標(biāo)本中有可能含有干擾試驗(yàn)的免疫物質(zhì)，導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身

7、抗體等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑；外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長及標(biāo)本凝固等， ELISA 的靈敏度1ng/ml,避免污染，與生化分杯。標(biāo)本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底加深，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常血清標(biāo)本可在28保存5天，冷凍保存時間會更長。血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融，標(biāo)本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價下降從而引起假陰性結(jié)果。標(biāo)本的采集及分離要注意盡量避免細(xì)菌的污染。此外，標(biāo)本在凍

8、存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標(biāo)本必須混勻，但不要劇烈振蕩和反復(fù)顛倒。,.,9,3 操作因素,3.1 加樣 加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機(jī)械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加樣速度不可太快，以免將標(biāo)本加在孔壁上部，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡，加樣時還應(yīng)注意操作時差對結(jié)果的影響，尤其對競爭法檢測結(jié)果影響更大。因此建議在加酶結(jié)合物和底物時用多道加液器，或者雙人同時加樣以減少操作時差對結(jié)果的影響，另外有些項(xiàng)目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應(yīng)。稀釋的方式非常重要，最佳方式

9、是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。,.,10,3.2 溫育,3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37、室溫或4等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度?？乖贵w反應(yīng)一般在37經(jīng)12 h 產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰，為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩來增加抗原抗體接觸的概率?？乖贵w反應(yīng)在4更為徹底，形成的產(chǎn)物更多、更穩(wěn)定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。,.,11,3.2 溫育,3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（

10、即“邊緣效應(yīng)”）?？蓪LISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應(yīng)板不能重疊放置，防止溫度擴(kuò)散的不均勻性。,.,12,3.3 洗滌,洗滌是ELISA不同于均相免疫學(xué)檢測技術(shù)的一大特征，洗滌在整個ELISA反應(yīng)過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，卻非常關(guān)鍵。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分，包括未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌液通常為含有一定濃度Tween 20 的緩沖液，

11、Tween 20 是一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，又含疏水基團(tuán)，在洗滌中的作用機(jī)制是借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白分子與固相的吸附。同時在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子脫離固相而進(jìn)入液相，最終被洗脫，。必須注意非離子去垢劑的使用濃度，最常用的洗滌液是含0.05 %Tween20，pH為中性的磷酸鹽緩沖液，如果洗滌液中的Tween20 超過0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗體解吸附而影響實(shí)驗(yàn)的測定下限。洗滌可采用洗板機(jī)或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板內(nèi)注

12、液時應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機(jī)洗板時，要保證洗板機(jī)上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，要求洗板后殘液小于2 L ，即人工扣板墊紙不濕，浸泡時間超過45 s。,.,13,3.4 顯色,大多數(shù)情況下ELISA商品多選用HRP 和堿性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物為過氧化氫，參加反應(yīng)的顯色供氫體有鄰苯二胺（OPD）、鄰聯(lián)甲苯胺（OT）及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等。其中OPD 難溶于水，見光易變質(zhì)，使用前配制，反應(yīng)過程須避光且OPD有一定毒性。TMB 的反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色，目視對比鮮明，其性質(zhì)穩(wěn)定，對人體無毒。若選用各類酸性終止液，則會

13、使藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。TMB作底物時的產(chǎn)物檢測波長為450 nm ，ALP 作為標(biāo)記物，其底物一般采用對硝基苯磷酸酯（pNPP），產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，吸收波長是405 nm。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須要嚴(yán)格按照試劑盒說明書中規(guī)定的溫度和時間操作，不可隨意改變溫度和時間。,.,14,3.5 比色,ELISA 顯色結(jié)果必須通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，不可由肉眼判斷結(jié)果，因?yàn)椴煌瑐€體的色覺存在差異，尤其是對于乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體這樣的檢測項(xiàng)目，肉眼難以判斷。酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長進(jìn)行測定，包括對顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的2個吸收峰波長，用非敏感波長清除由于容器上的劃痕、指印、背景等造成的干擾。TM

14、B最大吸收波長為450 nm ，非敏感波長為630 nm ，一般不設(shè)空白孔，否則會出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。加入終止液后應(yīng)盡快比色，否則樣本吸光度值會逐漸下降，顯色越深下降越快，應(yīng)在2-30 min 內(nèi)比色。嚴(yán)格按照說明書操作,.,15,3.6 應(yīng)加強(qiáng)檢測儀器的質(zhì)量控制,如定量移液器要定期校準(zhǔn)；洗板機(jī)要及時傾倒廢液罐，補(bǔ)充洗滌液，開機(jī)后運(yùn)行沖洗程序（雙蒸水），檢查系統(tǒng)液路系統(tǒng)（有無漏水），檢查吸液和注液速度，關(guān)機(jī)運(yùn)行沖洗程序（雙蒸水），清洗吸針及水箱，儀器外觀清潔；酶標(biāo)儀要定期檢查濾光片是否合格，光源是否穩(wěn)定，機(jī)械系統(tǒng)是否有故障，保持外觀清潔，并定期請廠家工程師進(jìn)行保養(yǎng)維修；水浴箱及存放試劑的

15、冰箱要每天監(jiān)測溫度，并有記錄等。,.,16,4 結(jié)果的判定與報告,4.1 結(jié)果的判定 嚴(yán)格依據(jù)試劑盒提供的陽性判定值（C.O）進(jìn)行結(jié)果判定。廠商提供試劑的同時，說明書上列出的C.O值是建立在一系列科學(xué)試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)研究的基礎(chǔ)上，不應(yīng)隨意更改，注意說明書版本更新、換廠家。 定量測定需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。定性試劑禁止用于定量檢測,.,17,4 結(jié)果的判定與報告,.,18,4.2 灰區(qū)的設(shè)置,通常情況下ELISA結(jié)果報告方式為“陰性”或“陽性”，在二者之間有一條明確的分界線，也就是所謂的陽性判定值即C.O值，對于樣本的吸光度值（A）高于C.O值就判斷為陽性，相反則判斷為陰性，然而在實(shí)際

16、工作中經(jīng)常會出現(xiàn)樣本A 值位于C.O 值附近的人群，即ELISA 檢測的“灰區(qū)”。在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及到“灰區(qū)”的設(shè)置，僅僅依靠C.O值來決定感染的有無，尤其是對醫(yī)鬧群體的篩查具有較大風(fēng)險。我們在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，結(jié)果處于C.O值附近的患者重復(fù)性很差，也是容易引起醫(yī)療糾紛的人群。因此對于檢測結(jié)果位于“灰區(qū)”的患者可采用確認(rèn)試驗(yàn)或追蹤檢測方法加以確診。 “灰區(qū)”是現(xiàn)實(shí)事物對人類主觀認(rèn)識的回應(yīng),.,19,4.3 標(biāo)本的復(fù)查,ELISA 手工操作過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果差異，因此制定復(fù)查制度及加大復(fù)查力度可保證結(jié)果的

17、準(zhǔn)確性，比如對乙肝“兩對半”處于“灰區(qū)”的標(biāo)本及少見模式的檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。在實(shí)際工作中嚴(yán)格執(zhí)行復(fù)查制度。 動態(tài)變化的事物，部分人總是假想為一成不變的,.,20,5 質(zhì)量控制,5.1 室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC） 要保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，必須做好IQC，首先要保證實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、儀器設(shè)備與硬件設(shè)施必須處于良好的狀態(tài)，其次要對試劑及測定方法過程進(jìn)行理想化，另外實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須經(jīng)過良好的培訓(xùn)。ELISA 定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)。因此質(zhì)量控制要保證試驗(yàn)的靈敏度，目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室定性試驗(yàn)的質(zhì)控規(guī)則還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，較多單位采用“即刻法”，結(jié)合LeveyJennings 質(zhì)控圖的方

18、法。在每塊反應(yīng)板中除了試劑盒附帶的陰陽性對照外，還要選擇至少2個室內(nèi)質(zhì)控品，其中一個為弱陽性的質(zhì)控品接近C.O值，S/C.O值應(yīng)該為24之間，另一個為陰性質(zhì)控品。認(rèn)真分析每次IQC失控的原因，定期對各項(xiàng)檢測的均值、變異系數(shù)等進(jìn)行比對分析，及時發(fā)現(xiàn)試劑盒檢出能力的變化，采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邫z測的可靠性。,.,21,5.2 室間質(zhì)量評價（EQA）,EQA 是一種回顧性評價，主要是控制實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確性。其要點(diǎn)是保證同一患者的標(biāo)本一樣對待室間質(zhì)評物，必須強(qiáng)調(diào)的是EQA結(jié)果必須同IQC一并分析，找出原因，改進(jìn)工作中的不足，同時指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室選擇合適的試劑盒。 綜上所述，ELISA檢測操作步驟復(fù)雜，可能會影響測定結(jié)果的因素較多，分布在測定操作的各個步驟中，因此必須加強(qiáng)各環(huán)節(jié)的質(zhì)