實驗五 血凝及血凝抑制實驗

1、實驗二 血凝及血凝抑制實驗,實驗?zāi)康?血凝試驗：滴定病毒的血凝效價(病毒的凝集價)，采用一定的病毒量，通常采用4個血凝單位。 血凝抑制試驗： 應(yīng)用標準病毒液測定血清中的相應(yīng)抗體或應(yīng)用特異性抗體鑒定新分離的血凝性病毒 檢測實驗用雞群有無病毒感染和監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)。 掌握基本操作技術(shù),了解其實用價值 ,實驗原理,流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖,刺突：亞型特異性抗原，易變異,血凝素（HA，從H1H15):呈柱狀 功能： 吸附細胞：與細胞上受體結(jié)合,使病毒 侵入細胞 凝集多種動物的紅細胞（血凝試驗） 具抗原性：其抗體能中和病毒-中和抗體 抑制血凝（血凝抑制試驗）,血凝試驗原理,血凝素（hemagglutinin

2、HA）：由病毒基因編碼的糖蛋白刺突。 與病毒吸附和傳入宿主細胞有關(guān)。 HA能與人或其它動物多種紅細胞表面N乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細胞凝集。 為病毒的 紅細胞凝集反應(yīng)或血凝反應(yīng)。,血凝原理,血凝抑制原理,血凝抑制試驗原理 病毒引起的血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)的抗血凝素抗體所抑制，即抗體與病毒結(jié)合后，血凝素無法吸附于紅細胞表面的受體上，用免疫血清阻止紅細胞凝集的現(xiàn)象，稱為血凝抑制,實驗材料 器材：U型或V型微量反應(yīng)板、微量移液器、槍頭 試劑：1%雞紅細胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理鹽水,實驗步驟 1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實驗臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不

3、加。第12孔加25ul生理鹽水 2.在第1孔內(nèi)加入血凝素25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。,3.在1-12孔均加入25ul的生理鹽水。 4.在每孔內(nèi)加入25ul1%的雞紅細胞懸液，震蕩，室溫靜止感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。 5.計算血凝效價，稀釋使成為四價備用,血凝試驗結(jié)果判定,效價判定： 凝集特別顯著：“” 凝集現(xiàn)象次之：“” 凝集清楚可見：“” 稍顯凝集者：“” 血凝效價：呈“”凝集時的最高稀釋度。此時的稀釋度即為1個血凝單位。,結(jié)果判定 1.在各組對照均正確的情況下，按

4、下列標準判定 血凝反應(yīng)強度示意圖 “4” 紅細胞呈片狀凝集，均勻布滿孔底，邊緣有時不整齊或皺縮。 “3” 紅細胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”。 “2” 紅細胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點狀。 “” 紅細胞大部分沉于孔底中央，周圍有少量散在凝集顆粒。 “” 紅細胞均沉于孔底呈小圓點狀，邊緣整齊。 2.對照孔正常的情況下，紅細胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價的終點。凡能使雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價。,血凝抑制 1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實驗臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水。 2.在第1孔內(nèi)加入被

5、檢血清25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。,3.在1-12孔內(nèi)均加入“四價”血凝素25ul，震蕩后，室溫靜止作用5min。 4.在1-12 孔內(nèi)均加入1%的雞紅細胞懸液25ul，震蕩，室溫感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。 5.觀測結(jié)果，記錄實驗數(shù)據(jù),血凝抑制試驗結(jié)果判定,測定孔 RBC沉于孔底中心，呈紐扣狀。(+) 凝集 （-） 病毒對照孔：凝集 RBC對照孔：無自凝 血凝抑制試驗效價：呈完全血凝抑制使的最高血清稀釋度。,思考題 1、病毒凝集紅細胞是不是一種特異的抗原體反應(yīng)？為什么？ 2、血凝抑制實驗是不