《食品和化妝品中抗氧化功效的測(cè)定 體外角質(zhì)細(xì)胞SOD酶活法》

ICS67.050

CCSX04

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDFCA0XX—202X

食品和化妝品中抗氧化功效的測(cè)定體外

角質(zhì)細(xì)胞SOD酶活法

Determinationofantioxidantactivityinfoodsandcosmetics--Invitrokeratinocyte

SODenzymeactivitymethod

2022-xx-xx發(fā)布2022-xx-xx實(shí)施

廣東省食品流通協(xié)會(huì)發(fā)布

T/GDFCA0XX—202X

食品和化妝品中抗氧化功效的測(cè)定體外角質(zhì)細(xì)胞SOD酶活性法

1范圍

本文件規(guī)定了角質(zhì)細(xì)胞分泌物SOD活性測(cè)定試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。

本文件提供了一種經(jīng)由角質(zhì)細(xì)胞分泌物SOD活性的檢測(cè)方法，可作為化妝品、食品原料關(guān)于抗氧化

功效稱謂的證據(jù)支持之一。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。

SN/T3899—2014化妝品體外替代試驗(yàn)良好細(xì)胞培養(yǎng)和樣品制備規(guī)范。

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

人永生化角質(zhì)細(xì)胞HaCaT

該細(xì)胞來(lái)源于正常成年人的皮膚組織，是在體外培養(yǎng)后自然轉(zhuǎn)化的永生化的人角質(zhì)細(xì)胞。角質(zhì)細(xì)胞

是構(gòu)成人體表皮的主體細(xì)胞，體內(nèi)呈分層生長(zhǎng)排列，可用于人表皮細(xì)胞角化的研究。

超氧化物歧化酶Superoxidedismutase，SOD

超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，可在角質(zhì)細(xì)胞、肝臟組織等胞內(nèi)生產(chǎn)，它可以催

化超氧陰離子(O2-)的歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫和單質(zhì)氧。

4原理

生物體內(nèi)的自由基已成為研究的熱點(diǎn)，超氧化物歧化酶(SOD)作為天然的抗氧化酶，可在細(xì)胞內(nèi)

生成。在測(cè)定SOD活性時(shí)，SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，所以基于NBT或WST的顯色反應(yīng)可以

被SOD所抑制，因此SOD的活性與甲臜染料的生成量成負(fù)相關(guān)，從而通過(guò)對(duì)顯色產(chǎn)物的比色分析即可計(jì)算

SOD的酶活力。通過(guò)比較陰性對(duì)照與受試物給藥組的顯色底物的吸光值，可計(jì)算SOD酶活上調(diào)率。

5試劑

除非另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、耗材

應(yīng)作無(wú)菌處理。

細(xì)胞培養(yǎng)涉及試劑及耗材

胰蛋白酶/EDTA溶液（0.25%胰酶溶液與0.02mol/LEDTA溶液1:1混勻），磷酸鹽緩沖液（PBS），

細(xì)胞培養(yǎng)瓶，青霉素-鏈霉素，DMEM培養(yǎng)基（含2mML-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖）或其他經(jīng)驗(yàn)證合適的

培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基需添加10%新生牛血清。

檢測(cè)涉及試劑及耗材

Western及IP細(xì)胞裂解液(CelllysisbufferforWesternandIP)：一種在非變性條件下裂解細(xì)

胞或組織樣品從而制備蛋白樣品的裂解液，苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）：

蛋白酶抑制劑，超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒，陽(yáng)性物質(zhì)：表兒茶素CAS490-46-0，制備高濃度樣

品溶液：二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、無(wú)水乙醇、滅菌超純水。

6材料

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微孔濾膜：0.22μm。

細(xì)胞培養(yǎng)板（規(guī)格24、12孔、6孔均可）。

細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

無(wú)菌旋蓋離心管（15和50mL），無(wú)菌離心管（1.5和2.0mL）。

7儀器和設(shè)備

天平：感量為0.1mg

生物安全柜：生物II級(jí)

恒溫水浴鍋

二氧化碳培養(yǎng)箱：37℃，5%CO2。

pH計(jì)：精度±0.1。

低溫離心機(jī)

渦旋振蕩器

微孔板酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)，配置450nm或560nm濾光片

高壓滅菌器

無(wú)菌微量移液器：1-10μL；20-200μL；100-1000μL

倒置顯微鏡

8試樣的制備

受試物準(zhǔn)備

8.1.1除非有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)證明儲(chǔ)備液可接受，否則受試物必須在使用前新鮮配置直接使用。

8.1.2水中溶解度受限的受試物應(yīng)當(dāng)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲校軇w積應(yīng)在所有培養(yǎng)物中保持一致，并

且無(wú)細(xì)胞毒性。

8.1.3受試物濃度的選擇應(yīng)避免出現(xiàn)沉淀和溶液呈現(xiàn)云霧狀。

8.1.4宜使用二甲基亞砜（DMSO）和無(wú)水乙醇為溶劑，其他低細(xì)胞毒性的溶劑也可使用。

8.1.5在使用溶劑前，應(yīng)仔細(xì)評(píng)估它們的特殊性質(zhì)，例如：是否與受試物發(fā)生反應(yīng)，或溶液中的化學(xué)

穩(wěn)定性。

8.1.6可使用渦旋混合/或超聲處理和/或加熱到適當(dāng)溫度等方法輔助溶解，除非這些操作會(huì)影響到受

試物的穩(wěn)定性。

樣品配制

8.2.1在無(wú)菌條件中，使用1.5mL或2.0mL無(wú)菌離心管完成樣品母液制備（制備量應(yīng)大于1.5mL），

使用0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾。

8.2.2受試物濃度應(yīng)通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)確定受試物的濃度范圍。例如選擇細(xì)胞活力≥90%，且細(xì)胞形

態(tài)與對(duì)照組無(wú)明顯差異的濃度。

9陽(yáng)性對(duì)照

每一次試驗(yàn)都應(yīng)同時(shí)使用陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。推薦陽(yáng)性對(duì)照物，如250μg/mL表兒茶素，具體

的給藥濃度可根據(jù)各試驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整；

據(jù)歷史資料，試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)為：SOD酶活性上調(diào)率≥20%。

10檢測(cè)步驟

細(xì)胞消化、接種

10.1.1采用胰蛋白酶/EDTA，具體消化濃度及用量需根據(jù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞特性確定：宜胰酶濃度為0.25%，

T25培養(yǎng)瓶胰酶用量1mL，T75培養(yǎng)瓶胰酶用量3mL。

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10.1.2倒置顯微鏡下觀察，至大部分細(xì)胞變圓并處于懸浮狀態(tài)時(shí)，加入體積為胰酶體積2～3倍的含

血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，并收集至離心管中，800r/min離心6min。離心結(jié)束后，棄掉上清

液，向離心管中加入一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基，彎頭吸管吹打混勻細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)

數(shù)。

接種鋪板

10.2.1用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至接種密度，接種至孔板中，孔板的規(guī)格可根據(jù)試驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，12

孔、24孔板及6孔板均可。

10.2.26孔板加液量為2mL，12孔板、24孔板加液量為1mL，細(xì)胞濃度為2×105cell/mL。

10.2.3接種結(jié)束后，放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h。

給藥

鋪板24h±2h后，細(xì)胞與底部融合率達(dá)到60-80%可開(kāi)展給藥操作。棄掉孔板各孔中的培養(yǎng)基，

開(kāi)展給藥操作。受試物孔中加入一定濃度受試物的培養(yǎng)基，陰性對(duì)照、空白對(duì)照和裸細(xì)胞孔中加入正

常培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照加入含有相應(yīng)濃度陽(yáng)性對(duì)照的培養(yǎng)基，陽(yáng)性孔加入含250μg/mL表兒茶素的培養(yǎng)

基。

每孔加液量視孔板規(guī)格而定，宜6孔板加液量為2mL，12孔板，24孔板加液量為1mL。且試

驗(yàn)平行n≥3；

制備樣品溶液

給藥處理24或48h后，吸出液體，使用PBS洗凈細(xì)胞。孵育時(shí)間可根據(jù)試驗(yàn)室細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)

整。

使用含有1mM的PMSF的裂解液進(jìn)行裂解細(xì)胞，宜6孔板加液量為200μL，12孔板，24孔板

加液量為100μL。處理1-2s后抽打混勻，轉(zhuǎn)移到離心管中。

在0-5℃下，在10,000×g離心15min，將上清液移入新的試管中，制成樣品溶液。

SOD酶活力檢測(cè)

10.5.1SOD檢測(cè)需要根據(jù)總SOD檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。如選用WST-1或WST-8法，

則檢測(cè)儀器需要配備450nm濾光片；如選用NBT法，則檢測(cè)儀器需要配備560nm濾光片。

10.5.2在正式檢測(cè)前，應(yīng)設(shè)定稀釋比例，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索確定樣品的稀釋比例，以保證檢測(cè)數(shù)值落

在檢測(cè)范圍內(nèi)。

11計(jì)算

SOD酶活性上調(diào)率的計(jì)算公式

C

SOD酶活性上調(diào)率=（1）100%

C0

式中：

C—受試物組的酶活力；

C0—空白組的酶活力。

12試驗(yàn)有效性驗(yàn)證

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12.1.1試驗(yàn)系統(tǒng)有效性判定：每批次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照組中SOD酶活性上

調(diào)率≥20%，則認(rèn)為試驗(yàn)系統(tǒng)有效。

12.1.2平行性判定：統(tǒng)計(jì)酶標(biāo)儀測(cè)得的各組平行孔間吸光度的標(biāo)準(zhǔn)差（StandardDeviation，SD），

并計(jì)算變異系數(shù)（CoefficientofVariation，C.V），C.V值≤20%，則認(rèn)為試驗(yàn)平行性有效。

13結(jié)果報(bào)告

上調(diào)率

上調(diào)率表示為平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。

顯著性

評(píng)價(jià)受試物影響SOD酶活性提高，需要受試物的上調(diào)率數(shù)值為正數(shù)，且與陰性對(duì)照的結(jié)果具有顯

著性差異（P<0.05）。

表述