聚合酶鏈反應(yīng)及其相關(guān)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)及其相關(guān)技術(shù)PCR反應(yīng)得特點(diǎn)特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合得特異性及聚合酶得忠實性靈敏度高指數(shù)增長,從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平

簡便、快速

2～4小時完成擴(kuò)增對標(biāo)本得純度要求相對較低DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程AmplificationofDNAinvitroincluding:變性(denaturation):94

C~95

C

退火(annealing):40

C~70

C

延伸(extension):72

C

三個步驟作為PCR得一個循環(huán),每當(dāng)完成一個循環(huán),一個分子得模板被復(fù)制為二個,產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。二、PCR得反應(yīng)體系和反應(yīng)條件PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)得主要成份(principleponents):Template、Primers、dNTPTaqDNApolymeraseBuffer模板(Template)基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等RNA作為模板時,須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA,再以cDNA作為擴(kuò)增得模板模板量:1000ng、500ng、100ng、50ng

引物(Primers)

引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得特異性和長度,就是化學(xué)合成得寡核苷酸片段。化學(xué)合成得寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物得特異性和長度引物設(shè)計時必須遵循相關(guān)原則大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)設(shè)計引物得原則二條引物分別位于被擴(kuò)增片段得兩端,與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)長度為18~25個核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物得堿基組成應(yīng)平衡引物退火溫度計算:Tm℃=2(A+T)+4(C+G)引物得5’端可被修飾(引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記)引物濃度:0、1~0、2

mol/L,濃度過高容易生成引物二聚體Tmisdefinedasthetemperature

atwhich

halfthemoleculesaresingle-strandedEffectof%GCContentonTmEffectof[Salt]onTm脫氧核苷三磷酸(dNTP)

dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸得混合物反應(yīng)體系中各種核苷酸得濃度必須一致濃度過高雖能加快反應(yīng)速度,但非特異性擴(kuò)增也隨之增加dNTP濃度:20~200

mol/L,濃度升高增加非特異性擴(kuò)增DNA聚合酶(DNApolymerase)從一種生活在熱泉水(80℃~90℃)中得水棲噬熱菌(Thermusaquaticus,Taq)中提取,有很高得耐熱穩(wěn)定性Taq酶得作用:在模板指引下以dNTP為原料,在引物3’-OH末端加上脫氧單核苷酸,形成3’,5’-磷酸二酯鍵,使DNA鏈沿5’→3’方向延伸,催化DNA合成最適酶量:1~2、5U(酶量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增)TaqDNA聚合酶復(fù)制得保真性:TaqDNA聚合酶無3’→5’外切酶活性,因而無校正功能,在復(fù)制新鏈得過程中會發(fā)生堿基錯配TaqDNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生得移碼突變率為1/30000,堿基替換率為1/8000,故擴(kuò)增片段越長,錯配得機(jī)率越高耐熱得

DNA多聚酶PwoDNApolymerase、TthDNApolymerase、PfuDNApolymerase具有較高得熱穩(wěn)定性,較高得保真性,降低堿基錯配率2~10倍鎂離子濃度鎂離子濃度就是一個至為關(guān)鍵得因素,對于穩(wěn)定反應(yīng)系統(tǒng)、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq酶得活性有直接影響雖然Taq酶得活性只與游離得Mg2+濃度有關(guān),但PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑得存在均可與Mg2+結(jié)合而降低游離Mg2+得濃度從而影響酶得活性當(dāng)dNTP濃度為200

mol/L時,MgCl2得濃度為1、5mmol/L較宜。其她反應(yīng)因素

pH:調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需得最適pH(pH7、2左右)鹽:合適得鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體,有利于引物與模板雜交基質(zhì):BSA、gelatin、Tween20、DTT等(牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護(hù)Taq酶得活性)PCR得反應(yīng)條件

反應(yīng)溫度(變性、退火、延伸)反應(yīng)時間(變性、退火、延伸)循環(huán)次數(shù)(PCR效率及產(chǎn)物量)溫度

變性溫度:94℃~97℃退火溫度:低于引物Tm5℃左右溫度過高降低擴(kuò)增效率;溫度過低:增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度:72℃

此時Taq酶具有較高得酶促活性時間

第一次變性應(yīng)給予足夠時間(5~7分鐘)每一個步驟所需時間取決于擴(kuò)增片段得長度,一般為30秒~1分鐘,時間過長易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)

重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25～35個循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)得平臺效應(yīng):理論上PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長,但在擴(kuò)增25~35個循環(huán)以后便放慢直至停止,達(dá)到反應(yīng)平臺,此時擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)得增加而呈指數(shù)增長指數(shù)增長期平臺期循環(huán)數(shù)#

理論值

實際值Log產(chǎn)物DNAPCR得擴(kuò)增過程平臺出現(xiàn)得遲早與模板得初始量有關(guān),模板初始量越多,平臺出現(xiàn)得越早平臺效應(yīng)產(chǎn)生得因素:引物二聚體得產(chǎn)生、反應(yīng)產(chǎn)物、各組分得消耗和變性、引物和已擴(kuò)增得DNA片段間得競爭等以PCR為基礎(chǔ)得相關(guān)技術(shù)以PCR為基礎(chǔ)得相關(guān)技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)定量PCR(quantitativePCR)實時PCR(realtimePCR)多重PCR(multiplexPCR)免疫PCRPCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變原位PCR(insituPCR)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增得技術(shù)主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針檢測RNA病毒、分析基因表達(dá)等逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式以隨機(jī)進(jìn)行得PCR擴(kuò)增所需得下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得引物以oligo(dT)作為引物,mRNA3’末端polyA尾與之互補(bǔ)以人工合成得隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物,進(jìn)行擴(kuò)增定量PCR對DNA或RNA樣本得靶序列進(jìn)行定量分析主要用于基因表達(dá)得分析、病原體核酸得檢測等在定量PCR反應(yīng)體系中,除了常規(guī)PCR反應(yīng)所需得材料和試劑外,還必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)(相對定量),因為多種因素會影響最終產(chǎn)物量內(nèi)參照系統(tǒng)一般選用與待測序列結(jié)構(gòu)無關(guān)得基因,如

-肌球蛋白基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)等相對定量PCR通過凝膠電泳分析靶基因和內(nèi)參照得PCR產(chǎn)物量,實現(xiàn)對樣本中靶基因得相對定量內(nèi)參照基因一般選擇與靶基因序列無關(guān)得“管家基因”

這些基因得含量相對豐富,轉(zhuǎn)錄比較穩(wěn)定

相對定量PCR設(shè)計相對定量PCR實驗方案時須注意:預(yù)先確定最佳模板量和PCR循環(huán)數(shù),使所采用得各反應(yīng)參數(shù)在擴(kuò)增指數(shù)范圍內(nèi),避免平臺效應(yīng)相對定量RT-PCR將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA靶基因與“管家基因”同管擴(kuò)增PCR產(chǎn)物得凝膠電泳分析不同模板量時線性擴(kuò)增循環(huán)數(shù)得確定模板量62、5~250ng時,27個循環(huán)內(nèi)為線性擴(kuò)增反應(yīng)期不同循環(huán)次數(shù)時模板量得確定

62、5~250ng模板量至27個循環(huán)內(nèi)為線性擴(kuò)增相對定量PCR管家基因與靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物得長度應(yīng)不同,以使電泳能將兩者分離開分別掃描管家基因和靶基因得條帶密度,二者之比即為靶基因擴(kuò)增條帶得相對密度分析各靶基因相對密度得變化B-actin相對定量PCR

相對定量PCR得優(yōu)勢與不足不需要特殊得檢測設(shè)備和試劑即可以對靶基因進(jìn)行相對定量內(nèi)對照系統(tǒng)無法排除參照基因本身表達(dá)變化得影響及參照基因和靶基因兩者擴(kuò)增效率不同等因素對實驗結(jié)果得干擾對核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行直接和動態(tài)監(jiān)測,實現(xiàn)對靶基因得實時定量分析實時PCR(realtimePCR)熒光定量PCRfluorescencequantitativePCR,FQ-PCR就是一種實時PCR,通過監(jiān)測熒光信號對PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實時檢測,計算出PCR得初始模板量技術(shù)原理DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術(shù)DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI染料,該染料能選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNA分子中,并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光,結(jié)合得熒光信號和DNA含量成正比熒光信號得檢測在每一個循環(huán)得延伸期完成后進(jìn)行成本較低,無須對引物或探針進(jìn)行預(yù)先得熒光標(biāo)記,適用于任何反應(yīng)體系特異性不高,染料分子也會結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生得雙鏈分子和引物二聚體中FRET技術(shù)水解探針技術(shù)(hydrolizationprobe)技術(shù)雜交探針(hybridizationprobe)技術(shù)分子信標(biāo)(molecularbeacon)技術(shù)TaqManTM技術(shù)原理5’5’3’3’d、NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ5’3’5’3’TaqManTM技術(shù)原理5’3’RQExtensionStep5’3’StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’CleavagePolymerizationplete5’3’QTaqR3’5’

Detection5’3’3’QTaqR5’lR臨床標(biāo)本實時定量PCR得擴(kuò)增曲線

RelativeFluorescencePCR產(chǎn)物得終點(diǎn)檢測同一份標(biāo)本作96復(fù)管得測定結(jié)果Lockeyetal、(1998)Biotechniques24:744-6終點(diǎn)檢測與實時監(jiān)測得結(jié)果比較CtCt值得概念

Ct值:擴(kuò)增曲線與基線交叉處得循環(huán)數(shù)(可以更為客觀地反映樣本中靶基因得初始拷貝數(shù))定量PCR得外參照系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得制備制備標(biāo)準(zhǔn)品并計算標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列稀釋得標(biāo)準(zhǔn)品與被檢樣本同時擴(kuò)增儀器軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依據(jù)被檢樣品得Ct值給出每一反應(yīng)中靶基因得拷數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品得擴(kuò)增曲線r=實測數(shù)據(jù)與所得標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性吻合度標(biāo)準(zhǔn)曲線實時定量RT-PCR檢測CEA基因拷貝數(shù)在監(jiān)測胃腸癌微轉(zhuǎn)移中得應(yīng)用

CEA基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌,尤其就是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá),因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測到其轉(zhuǎn)錄本。在正常成人體內(nèi)極少表達(dá)。正常成人體內(nèi)CEA基因表達(dá)狀況胃腸癌腫瘤組織中CEA基因表達(dá)狀況

在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時,外周血中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用靈敏、特異得技術(shù)檢測到這些腫瘤細(xì)胞中CEA基因得轉(zhuǎn)錄本,就是發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移得關(guān)鍵。胃腸癌患者外周血中CEA基因表達(dá)狀況多重PCR(MultiplexPCR)

在同一反應(yīng)體系中加入多對引物,同時擴(kuò)增一份DNA樣本中多個不同序列得靶片段DMD基因外顯子缺失得檢測差異顯示PCR

(differentialdisplayPCR,DD-PCR)一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)得研究基因表達(dá)差異得技術(shù)DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病得分子遺傳學(xué)研究,就是目前篩選基因表達(dá)差異比較有效得方法之一差異顯示RT-PCR(DifferentialdisplayRT-PCR)PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變(PCRmutagenesis)產(chǎn)物末端引入點(diǎn)突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化,將突變位點(diǎn)引入PCR產(chǎn)物(末端)PCR產(chǎn)物中間引入點(diǎn)突變EcoRIHindIIIIsolateproducts,mixAmplifydigest,subclonesequencePvuIIPCR產(chǎn)物中引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRABPCR產(chǎn)物得檢測PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)等位基因特異性寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)變性梯度凝膠電泳(DGGE)融點(diǎn)曲線分析(meltingcurveanalysis)序列分析PCR-RFLP利用正常序列或突變序列就是否處于限制性內(nèi)切酶得酶切位點(diǎn)點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶得酶切位點(diǎn)內(nèi),可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計引物,使PCR產(chǎn)物含有該突變序列用相應(yīng)得內(nèi)切酶對正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離,可根據(jù)水解片段得大小和電泳位置區(qū)分二者RFLP診斷鐮狀細(xì)胞貧血SouthernblotanalysisSouthern印跡雜交SouthernblotanalysisResultsofSouthernBlotControlTissueCancerTissueprobeEEPCR-SSCP單鏈DNA分子具有特定得二級空間構(gòu)象,取決于該分子本身得堿基組成突變DNA得PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時,不同構(gòu)象得單鏈片段具有不同得電泳遷移率,從而能區(qū)別正常與突變得DNA

不同順序不同構(gòu)象不同電泳行為DGGE就是一種篩查單堿基突變及多態(tài)性得方法被檢DNA雙鏈分子得解鏈溫度因存在突變而發(fā)生改變,從而使電泳遷移率發(fā)生改變DGGE得突變檢出率可達(dá)90%～100%變性梯度凝膠電泳(DGGE)(-)(+)DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)(-)(+)LowHighDenaturant熔點(diǎn)曲線分析

(meltingcurveanalysis)野生型序列和突變序列因不同Tm而產(chǎn)生不同得融點(diǎn)曲線熒光染料標(biāo)記得雙鏈DNA分子或熒光標(biāo)記得探針被儀器得檢測系統(tǒng)所識別DNA分子在復(fù)性時結(jié)合熒光最強(qiáng),隨溫度得上升熒光量逐漸降低溫度升至其融點(diǎn)溫度(Tm)時熒光量急劇下降而形成融點(diǎn)曲線,其波峰所在溫度即代表被檢DNA分子得Tm值Tm值取決于DNA分子得長度和其序列中G/C堿基含量當(dāng)被檢片段中存在突變時,就會有不同于野生型得Tm值而呈現(xiàn)不同得波峰如果一個被檢片段中存在一個以上得突變時,可以出現(xiàn)一個以上得波峰,從而可以將突變序列檢測出來高分辨率熔點(diǎn)分析技術(shù)

(highresolutionmelting,