T-LNSI 008-2024 人臍帶間充質(zhì)干細胞

ICS11.020CCSC05HumanumbilicalcordIT/LNSI008-2024 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4符號和縮略語 6檢驗方法 7檢驗規(guī)則 9標簽 10包裝、儲存及運輸 11廢棄物處理 附錄A（規(guī)范性）細胞存活率檢測細胞計數(shù)法 10附錄B（規(guī)范性）細胞標志蛋白檢測流式細胞法 12附錄C（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法 14附錄D（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法 16附錄E（規(guī)范性）成軟骨分化檢測阿爾新藍染色法 18附錄F（規(guī)范性）成瘤性檢測免疫缺陷小鼠檢測法 20附錄G（規(guī)范性）干細胞對淋巴細胞增殖抑制檢測干細胞共培養(yǎng)法 22T/LNSI008-2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化的文件結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、沈陽市再生生物醫(yī)學(xué)重點實驗室提出。本文件由遼寧省免疫學(xué)會歸口。本文件起草單位：沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、中國醫(yī)科大學(xué)干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究室、沈陽干細胞與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室、遼寧艾米奧干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究院、遼寧省細胞生物學(xué)學(xué)會、遼寧省生物技術(shù)協(xié)會、沈陽市干細胞與再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟、沈陽藥科大學(xué)、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、艾米奧國際干細胞醫(yī)院。本文件主要起草人：龐希寧、龐然、施萍、單風(fēng)平、王莉莎、赫甡、宋揚、徐東芬、荊晶、姜雯宇、高航、謝光麟、邵錫柱、王竟、孟濤、張美玲、聶宏光、郎宏鑫、劉曉玉、王喜良、張濤、趙峰、張殿寶、王瑞、李彩虹、李宏圖、潘長偉、孔娟、王哲、王蔚、殷軍、郭然、張寧、李曉航。1T/LNSI008-2024人臍帶間充質(zhì)干細胞本文件規(guī)定了人臍帶間充質(zhì)干細胞的技術(shù)要求、檢驗方法、檢驗規(guī)則、使用說明、標簽、包裝、儲存、運輸和廢棄物處理要求。本文件適用于人臍帶間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)和檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。WS213丙型肝炎診斷WS273梅毒診斷WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》T/CSCB0001-2022《人干細胞研究倫理審查技術(shù)規(guī)范》GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗操作規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1間充質(zhì)干細胞mesenchymalstemcells2T/LNSI008-2024主要來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，廣泛存在于全是多種組織中，可在體外培養(yǎng)擴增，并在特定條件下分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。3.2人臍帶間充質(zhì)干細胞humanumbilicalcordmesenchymalstemcells來源于人臍帶華氏膠組織，貼壁培養(yǎng)后呈紡錘形和梭形的成纖維細胞態(tài)，可在體外自我更新并具有成骨、成脂、成軟骨等分化能力的間充質(zhì)干細胞。4符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。CD——分化簇（ClusterofDifferentiation）DNA——脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EBV——皰疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型病毒性肝炎（HepatitisBVirus）HCMV——人巨細胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR——人類白細胞抗原-DR（HumanLeukocyteAntigen-DR）HTLV——人類嗜T細胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）IDO——吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase）IFN-γ——干擾素-γ（Interferon-γ)TNF-α——腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α)PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）STR——短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）TP——梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）5技術(shù)要求3T/LNSI008-20245.1原材料和輔料5.1.1應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。5.1.2應(yīng)建立供者細胞采集的供者評估與篩選標準、采集方法、運輸標準和交接標準，保證供者和細胞的安全。5.1.3供體應(yīng)篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并記錄結(jié)果。5.2分離與培養(yǎng)方法5.2.1分離及提取采用組織塊貼壁法從臍帶華氏膠組織中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞。進行人臍帶間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)。5.2.2人臍帶間充質(zhì)干細胞換液根據(jù)細胞的生長情況換液。5.2.3人臍帶間充質(zhì)干細胞傳代傳代操作應(yīng)密度適宜、及時、迅速。5.2.4人臍帶間充質(zhì)干細胞凍存凍存細胞程序降溫后置液氮中保存。5.2.5人臍帶間充質(zhì)干細胞復(fù)蘇取出凍存管進行快速融化，離心洗滌后進行培養(yǎng)。5.2.6人臍帶間充質(zhì)干細胞溶液人臍帶間充質(zhì)干細胞溶液為均質(zhì)狀態(tài)，無絮狀沉淀，細胞存活率≥90％。5.3關(guān)鍵質(zhì)量屬性5.3.1細胞形態(tài)細胞貼壁培養(yǎng)時呈紡錘形和梭形的成纖維細胞態(tài)，形態(tài)均一。4T/LNSI008-20245.3.2染色體核型正常核型應(yīng)為46,XX或46,XY且400-550條段階段未見染色體異常。5.3.3細胞存活率未凍存細胞存活率≥90%且凍存復(fù)蘇后細胞存活率≥70%。5.3.4細胞標志蛋白CD105、CD73、CD90陽性率均≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率≤2%。5.3.5三系分化具有成骨、成脂、成軟骨的分化潛能。5.3.6成瘤性免疫缺陷動物（如小鼠）體內(nèi)成瘤試驗結(jié)果為陰性。5.3.7微生物真菌、細菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP為陰性。5.3.8干細胞對淋巴細胞增殖抑制應(yīng)滿足下列要求：——共培養(yǎng)組與陽性對照組相比，白介素6、腫瘤壞死因子α表達下調(diào)，白介素10表達上調(diào)；——共培養(yǎng)組與陽性對照組相比，淋巴細胞增殖被顯著抑制；——共培養(yǎng)組與陽性對照組相比，淋巴細胞亞群輔助性T細胞上調(diào)，細胞毒性T淋巴細胞下調(diào)。5.4過程控制5.4.1擴增、凍存、復(fù)蘇等過程控制應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。5.4.2細胞STR檢測結(jié)果應(yīng)與供體細胞保持一致。5T/LNSI008-20246檢驗方法6.1細胞形態(tài)二維培養(yǎng)條件下，用明視場細胞顯微鏡×40倍進行觀察。6.2染色體核型按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”項檢驗。6.3細胞存活率按照附錄A的方法檢驗。6.4細胞表面標志物按照附錄B的方法檢驗。6.5三系分化6.5.1成骨分化按照附錄C的方法檢驗。6.5.2成脂分化按照附錄D的方法檢驗。6.5.3成軟骨分化按照附錄E的方法檢驗。6.6成瘤性按照附錄F的方法檢驗。6.7微生物6.7.1真菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢測。6T/LNSI008-20246.7.2細菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢測。6.7.3支原體按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301無菌檢查法”項檢測。6.7.4HBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.7.5HCV按照WS213核酸法檢驗。6.7.6HIV按照WS293-2019核酸法檢驗。6.7.7HTLV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.7.8EBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.7.9HCMV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.7.10TP按照WS273核酸法檢驗。6.8干細胞對淋巴細胞增殖抑制檢測按照附錄G的方法檢測。7檢驗規(guī)則7.1抽樣方法和數(shù)量7T/LNSI008-20247.1.1在一個生產(chǎn)周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一代次、同一方法制備出來的產(chǎn)品為一批。7.1.2在同一批的產(chǎn)品中隨機抽取3個最小包裝單元。7.2出廠檢驗7.2.1每批產(chǎn)品應(yīng)進行出廠檢驗，并附檢驗報告。7.2.2出廠檢驗項目應(yīng)包括5.3規(guī)定的所有項目。7.3復(fù)核檢驗若客戶需要，應(yīng)由第三方專業(yè)細胞檢驗機構(gòu)或?qū)嶒炇疫M行復(fù)核檢驗，檢驗項目應(yīng)包括第5章規(guī)定的所有項目。7.4判定規(guī)則7.4.1出廠檢驗項目全部符合5.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。7.4.2復(fù)核檢驗項目全部符合5.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。8使用說明應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：c）細胞數(shù)量；e）生產(chǎn)批號；f）生產(chǎn)組織；i）使用方法；8T/LNSI008-2024j）執(zhí)行標準號；k）生產(chǎn)地址；l）聯(lián)系方式；n）注意事項。注：根據(jù)用戶需求，可標注內(nèi)毒素含量。9標簽應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：c）細胞數(shù)量；e）生產(chǎn)組織；f）生產(chǎn)日期。10包裝、儲存及運輸10.1包裝應(yīng)選擇對人臍帶間充質(zhì)干細胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無影響的袋或瓶中，應(yīng)選用100毫升0.9%生理鹽水袋或瓶。10.2儲存10.2.1應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。10.2.2應(yīng)在低于-130℃環(huán)境下儲存。10.3運輸10.3.1應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。10.3.2凍存的細胞應(yīng)在干冰或低于-130℃條件下運輸，非凍存細胞建議在2℃~8℃下運輸。9T/LNSI008-202411廢棄物處理人臍帶間充干細胞生產(chǎn)和檢測過程中生產(chǎn)的廢棄物應(yīng)按照T/CSCB0001-2022中的規(guī)定處理。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）細胞存活率檢測細胞計數(shù)法A.1儀器和設(shè)備A.1.1明視場顯微鏡。A.1.2血球計數(shù)板。A.2試劑除特殊說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為18.2MΩ去離子水。A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。A.3檢測步驟A.3.1細胞懸液制備收集待檢測細胞，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）配制細胞懸液，稀釋至合適的濃度。每個血球計數(shù)板（A.1.2）的1mm2的方格中的細胞的數(shù)量應(yīng)為20個~50個細胞。如果高于200個細胞，則需要進行稀釋。A.3.2細胞染色按1:1的體積比將臺盼藍染液（A.2.2）與細胞懸液（A.3.1）混合均勻。A.3.3細胞計數(shù)將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板（A.1.2）計數(shù)槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜止30s，將計數(shù)板置明視場顯微鏡（A.1.1）下對被染色的細胞和細胞總數(shù)分別進行計數(shù)。對16×25規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個1mm2的中格（即100個小格）計數(shù)。對25×16規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下和中央5個中格（即80個小格）計數(shù)。當(dāng)遇到位于大格線上的細胞，一般只計數(shù)大方格的上方和左線上的細胞（或只計數(shù)下方和右方線上的細T/LNSI008-2024胞）。按步驟A.3.2~A.3.3在重復(fù)測定一個樣品。A.3.4細胞存活率計算A.4計算與分析細胞存活率按式（A.1）進行計算：X=(M-S)/X×100%.........................................（A.1）式中：X—細胞存活率；M—細胞總數(shù)；S—染色的細胞數(shù)。計算兩次計數(shù)細胞存活率結(jié)果的平均值，記為細胞平均存活率。A.5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的10%。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）細胞標志蛋白檢測流式細胞法B.1儀器和設(shè)備B.1.1流式細胞儀。B.1.2水平離心機。B.1.3電子天平。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.2.2牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。B.2.3疊氮鈉（NaN3）。B.2.4抗人CD105、CD73、CD90、CD11b、CD19、CD31、CD45、HLA-DR抗體及同型對照抗體。B.2.5按照相應(yīng)要求使用電子天平（B.1.3）配置流式檢測所需的液體：洗滌液、抗體稀釋液。B.3樣品保存洗滌液和標記后的樣品于2℃~8℃保存。相關(guān)抗體遵照說明書保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品準備收集細胞，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。然后，用洗滌液清洗一遍，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。B.4.2抗體孵育按照抗體說明書進行稀釋使用?？贵w孵育結(jié)束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。T/LNSI008-2024B.4.3過濾上機用洗滌液重懸細胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀（B.1.1）應(yīng)用手冊上機檢測。B.4.4圈門設(shè)定原則首先根據(jù)細胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標細胞分群1，排除死細胞和其他雜細胞，然后根據(jù)Isotype對照組熒光強度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細胞群2，排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞?？贵wIsotype作為陰性對照。B.5結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法C.1儀器和設(shè)備C.1.1血球計數(shù)板。C.1.2明視場顯微鏡。C.1.3水平離心機。C.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。C.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。C.2.2消化酶。C.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（C.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。C.2.4成骨誘導(dǎo)液。C.2.5茜素紅S染色試劑盒。C.3檢測步驟C.3.1細胞樣品的準備C.3.1.1細胞消化使用水平離心機（C.1.3）離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。C.3.1.2細胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（C.1.1）及明視場顯微鏡（C.1.2）計算細胞懸液活細胞濃度。C.3.2細胞接種并誘導(dǎo)細胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d~21d。T/LNSI008-2024C.3.3鈣結(jié)節(jié)染色鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進行。C.4結(jié)果分析顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法D.1儀器和設(shè)備D.1.1血球計數(shù)板。D.1.2明視場顯微鏡。D.1.3水平離心機。D.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。D.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。D.2.2消化酶。D.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（D.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。D.2.4成脂誘導(dǎo)液。D.2.5油紅O染色試劑盒。D.3檢測步驟D.3.1細胞樣品的準備D.3.1.1細胞消化使用水平離心機（D.1.3）離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。D.3.1.2細胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（D.1.1）及明視場顯微鏡（D.1.2）計算細胞懸液活細胞濃度。D.3.2細胞接種并誘導(dǎo)細胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成脂誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d~21d。T/LNSI008-2024D.3.3脂滴染色脂滴染色根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進行。D.4結(jié)果分析顯微鏡下可見橙紅色的脂滴，脂肪細胞中含大小不等的脂滴。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成軟骨分化檢測阿爾新藍染色法E.1儀器和設(shè)備E.1.1血球計數(shù)板。E.1.2明視場顯微鏡。E.1.3水平離心機。E.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。E.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。E.2.2消化酶。E.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（E.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。E.2.4成軟骨誘導(dǎo)液。E.2.5阿爾新藍染色試劑盒。E.3檢測步驟E.3.1細胞樣品的準備E.3.1.1細胞消化使用水平離心機（E.1.3）離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。E.3.1.2細胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（E.1.1）及明視場顯微鏡（E.1.2）計算細胞懸液活細胞濃度。T/LNSI008-2024E.3.2細胞接種并誘導(dǎo)細胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d~21d。E.3.3軟骨細胞外基質(zhì)染色軟骨細胞外基質(zhì)染色根據(jù)阿爾斯蘭染色試劑盒說明書進行。E.4結(jié)果分析顯微鏡下可深藍色的軟骨細胞胞外基質(zhì)。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成瘤性檢測免疫缺陷小鼠檢測法F.1儀器和設(shè)備F.1.1血球計數(shù)板。F.1.2明視場顯微鏡。F.1.3水平離心機。F.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。F.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。F.2.2消化酶。F.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（F.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。F.3檢測步驟F.3.1細胞樣品的準備F.3.1.1細胞消化使用水平離心機（F.1.3）離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。F.3.1.2細胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（F.1.1）及明視場顯微鏡（F.1.2）計算細胞懸液活細胞濃度。F.3.2細胞移植將1×107個人臍帶間充質(zhì)干細胞注射到6至8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，設(shè)置空白對照組（空白組注射與產(chǎn)品對應(yīng)的溶媒）、陰性對照組（人二倍體細胞）、陽性對照組（人腫瘤細胞系、按照腫瘤T/LNSI008-2024細胞系接種要求的數(shù)量注射）。F.3.3腫瘤觀察接種后觀察16周，每周測量體重、腫瘤大小。若荷瘤小鼠腫瘤超過2000mm3或者腫瘤潰爛或體重下降，可考慮執(zhí)行人道終點。16周后剝離小鼠身上腫瘤，行大體觀察，瘤體稱重，計算成瘤率。F.4結(jié)果分析成瘤率按式（F.1）進行計算：Z=N/M×100%.................................（F.1）式中：Z—成瘤率；M—接種小鼠總數(shù)；N—荷瘤小鼠總數(shù)。T/LNSI008-2024干細胞對淋巴細胞增殖抑制檢測干細胞共培養(yǎng)法G.1儀器和設(shè)備G.1.1血球計數(shù)板。G.1.2二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。G.1.3水平離心機。G.1.448孔細胞培養(yǎng)板。G.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。G.2.1人臍帶間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基。G.2